牛廣俊，朱 思，王維華，魏藝聰，林 娜，陳清英，梁一池

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122； 2.漳平市展宏金花茶專業(yè)合作社，福建 漳平 364400)

基于抗氧化活性優(yōu)化金花茶花超聲提取工藝

牛廣俊1，朱 思1，王維華1，魏藝聰1，林 娜1，陳清英2，梁一池1

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122； 2.漳平市展宏金花茶專業(yè)合作社，福建 漳平 364400)

以金花茶的花為研究對(duì)象，探討乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)金花茶花超聲提取物抗氧化能力的影響；在此基礎(chǔ)上，以提取物的抗氧化能力為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，優(yōu)化金花茶花超聲提取工藝。結(jié)果表明，金花茶花最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)51%、料液比1∶48 g·mL-1，提取時(shí)間53 min。在此條件下，提取物抗氧化能力是陽性對(duì)照藥DL-α-生育酚(0.218 mg·mL-1)的1.5倍。金花茶花提取液中三大抗氧化物質(zhì)總酚、總黃酮、皂苷的得率分別為：6.25%、17.18%、13.26%。

金花茶；抗氧化能力；響應(yīng)曲面法；超聲提取工藝

金花茶(CamelliachrysanthaChi)是山茶科山茶屬金花茶組植物，常綠灌木或小喬木，主要分布在廣西省和福建省部分地區(qū)，具有極高的觀賞價(jià)值。金花茶的出現(xiàn)填補(bǔ)了山茶科黃色花色的空白，引起國內(nèi)外植物學(xué)界和園藝學(xué)界的廣泛關(guān)注，有“茶族皇后”的美稱，已列入國家一級(jí)保護(hù)植物。金花茶花不僅具有極高的觀賞價(jià)值，而且金花茶花中含有較多的黃酮、多糖、皂苷、茶多酚等抗氧化活性成分，具有廣泛的藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值，因此又被譽(yù)為“國寶神茶”[1]。目前，從植物中尋找高效、廉價(jià)、低毒的天然抗氧化劑成為抗氧化劑的發(fā)展趨勢，金花茶花因具有較強(qiáng)的抗氧化作用[2]引起廣泛關(guān)注。多指標(biāo)優(yōu)化提取工藝研究是近年來中藥生產(chǎn)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，單一指標(biāo)的優(yōu)化不能滿足生產(chǎn)管理的需要[3]。關(guān)于金花茶花中活性成分的提取工藝的研究，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為了更好地利用經(jīng)濟(jì)作物資源，本文利用中藥整體性觀念，以茶、藥兩用佳品金花茶花為例，以DL-α-生育酚為陽性對(duì)照藥物，以提取物對(duì)DPPH自由基消除能力為抗氧化評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法[4-5]對(duì)金花茶花抗氧化活性物質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。利用所優(yōu)化的提取條件同時(shí)提取金花茶花中抗氧化活性成分，計(jì)算總黃酮、總皂苷、茶多酚的得率，確定最佳提取工藝，以期為金花茶花綜合開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑

金花茶的花由漳平市展宏金花茶專業(yè)合作社提供，烘干粉碎后過60目，備用。所有試劑均為分析純：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，西格瑪奧德里奇公司；蘆丁、沒食子酸、人參皂苷Rg1，成都曼斯特生物科技有限公司；香蘭素、三氯化鐵·六水、鐵氰化鉀、十二烷基硫酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。水為超純水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士帝肯(Tecan)公司)；Costar 96孔酶標(biāo)板(美國康寧(Corning)公司)；UV-9100紫外-可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)；THC-10B數(shù)控超聲波提取器(濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司)等。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素試驗(yàn) 單因素試驗(yàn)考察乙醇不同體積分?jǐn)?shù)(30%、50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g·mL-1)、提取時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)3個(gè)因素對(duì)金花茶花提取物抗氧化能力的影響。

1.3.2 提取工藝最優(yōu)參數(shù)的確定 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以金花茶花提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力為指標(biāo)，依次改變提取液的乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間，進(jìn)行對(duì)比分析，并確定三因素三水平的最佳提取參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平及編碼見表1。

1.4 金花茶花抗氧化活性物質(zhì)提取流程

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平

精密稱取金花茶花粉末1.0 g，置于100 mL的錐形瓶中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定的工藝條件提取，補(bǔ)齊提取液到60 mL，12000 r·min-1離心10 min，取上清液1.0 mL，定容至10 mL，得金花茶花供試品溶液。

1.5 DPPH自由基消除率的測定

精密移取DPPH工作液(A值在1.2～1.3之間)1.0 mL置于2.0 mL離心管中，精密加入提取液50 μL，充分搖勻，靜置反應(yīng)30 min。反應(yīng)完成后取100 μL置于96孔酶標(biāo)板中，于519 nm處測定A值。同時(shí)取DPPH工作液1.0 mL于離心管中，加入無水乙醇50 μL，充分混合，30 min后取100 μL置于96孔酶標(biāo)板中，于519 nm處測定A0值，以DL-α-生育酚0.218 mg·mL-1為陽性對(duì)照藥，按下式計(jì)算清除率。DPPH自由基清除率(%)=(1-A/A0)×100%。

1.6 抗氧化活性成分得率的測定

按照文獻(xiàn)[6]報(bào)道的方法，分別采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法、普魯士藍(lán)法、高氯酸比色法測定提取液中總黃酮、總酚、總皂苷的含量，按下式計(jì)算得率，活性成分提取率(%)= 提取液中所測成分的質(zhì)量/原料總質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 固定料液比為1∶50 g·mL-1，提取時(shí)間為30 min，室溫，超聲功率為500 W，40 kHz，考察不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)抗氧化活性物質(zhì)的影響，結(jié)果見表2。提取物的抗氧化能力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高表現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，抗氧化活性成分易溶于50%乙醇。綜合考慮其他影響因素，選取體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%的乙醇進(jìn)行響應(yīng)面分析，以確定乙醇最佳提取體積分?jǐn)?shù)。

2.1.2 提取時(shí)間 固定料液比為1∶50 g·mL-1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，超聲功率為500 W、40 kHz，考察不同提取時(shí)間對(duì)抗氧化活性物質(zhì)的影響，結(jié)果見表3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間為40 min時(shí)，提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，隨著提取時(shí)間延長，提取物抗氧化能力有所下降，分析原因是長時(shí)間超聲會(huì)破壞抗氧化活性成分。綜合考慮其他影響因素，選取提取時(shí)間分別為20、40、60 min進(jìn)行響應(yīng)面分析，以確定最佳提取時(shí)間。

表2 乙醇提取分?jǐn)?shù)對(duì)金花茶花提取物抗氧化能力的影響

表3 提取時(shí)間對(duì)金花茶花提取物抗氧化能力的影響

2.1.3 料液比 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時(shí)間為40 min，室溫，超聲功率為500 W、40 kHz，考察不同料液比對(duì)抗氧化活性物質(zhì)的影響，結(jié)果見表4。發(fā)現(xiàn)料液比為1∶50 g·mL-1后增大液料比對(duì)DPPH自由基的清除能力無顯著的增強(qiáng)，說明抗氧化成分在50倍的溶劑中得到充分溶解。綜合考慮其他影響因素，選取液料比分別為1∶40、1∶50、1∶60 g·mL-1進(jìn)行響應(yīng)面分析，以確定最佳料液比。

表4 料液比對(duì)金花茶花提取物抗氧化能力的影響

2.2 響應(yīng)面法提取條件的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間為考察因素，采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行分析與設(shè)計(jì)試驗(yàn)，測定各個(gè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力，金花茶花中抗氧化物質(zhì)提取的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見表5。

應(yīng)用Design-Expert 8.0 軟件對(duì)表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸分析，得A、B、C 3因素與金花茶花中抗氧化物質(zhì)對(duì)DPPH自由基消除率的二元多項(xiàng)回歸方程：Y=51.48+0.55A+0.39B+2.32C+1.04AB+0.25AC-1.72BC-6.64A2-1.43B2-2.11C2。對(duì)所得回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表6。

由表6可知，因變量與全體自變量的線性關(guān)系顯著(r=0.9117)，模型的顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.05，而方程的失擬項(xiàng)顯著性水平大于0.05，說明未知因素對(duì)方程干擾小，所建立的方程可靠。各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，影響提取物抗氧化活性的因素順序?yàn)椋禾崛r(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比。由響應(yīng)面分析(圖1～圖3)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取物的抗氧化能力隨3個(gè)因素水平的增大均呈先增加后減少的趨勢；B與C交互作用最強(qiáng)，A與C交互作用最弱，與表3得出的結(jié)論一致。

表5 金花茶花中抗氧化物質(zhì)的超聲提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

*：以DL-α-生育酚0.218 mg·mL-1為陽性對(duì)照藥。

2.2.2 預(yù)測模型的驗(yàn)證及抗氧化活性成分得率的計(jì)算 響應(yīng)面模型預(yù)測的最優(yōu)提取條件是用50.69%的乙醇，以料液比為1∶47.55 g·mL-1，室溫下超聲提取52.99 min，預(yù)測所得提取物對(duì)DPPH自由基消除率為52.19%。由于設(shè)備的限制，在現(xiàn)有條件下，對(duì)優(yōu)化條件稍作調(diào)整：以料液比為1∶48 g·mL-1，體積分?jǐn)?shù)為51%的乙醇，室溫下超聲提取53 min。取6份相同樣品，按上述條件進(jìn)行提取，以DL-α-生育酚0.218 mg·mL-1為陽性對(duì)照藥，測定各個(gè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力，及總黃酮、總酚、總皂苷的得率，重復(fù)測定3次，結(jié)果見表7。

表6 超聲提取工藝回歸模型方差分析

*：**為極顯著(P< 0.01)；*為顯著(0.01

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比對(duì)提取物消除DPPH自由基能力的影響圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間對(duì)提取物消除DPPH自由基能力的影響

表7 6份金花茶花樣品提取物對(duì)DPPH消除率及抗氧化物質(zhì)得率 %

圖3 提取時(shí)間與料液比對(duì)提取物消除DPPH自由基能力的影響

試驗(yàn)測得數(shù)據(jù)與模型預(yù)測數(shù)據(jù)的相對(duì)誤差為0.5%，沒有顯著性差異，說明利用該模型提取金花茶花中抗氧化活性成分穩(wěn)定、可行。

3 結(jié)論

本文采用超聲提取金花茶花中抗氧化活性成分，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)曲面法首次應(yīng)用于優(yōu)化金花茶花中抗氧化物質(zhì)的同時(shí)提取?？疾炝艘掖俭w積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間對(duì)所得提取物的抗氧化能力的影響，得到最佳提取條件：料液比為1∶48 g·mL-1，51%的乙醇，室溫下超聲提取53 min。在此條件下，金花茶花提取物的生藥濃度為16.667 mg·mL-1，金花茶花中三大抗氧化物質(zhì)總酚、總黃酮、皂苷的得率分別為6.25%、17.18%、13.26%，提取物對(duì)DPPH自由基消除率為51.92%，以DL-α-生育酚0.218 mg·mL-1為基準(zhǔn)，金花茶花提取物消除DPPH自由基的能力是其1.5倍。DDPH自由基并非人體實(shí)際產(chǎn)生的自由基，但是 DDPH自由基的猝滅能力仍然可以有效地評(píng)價(jià)抗氧化劑的活性，因此在所優(yōu)選的提取工藝下，金花茶花提取物有較強(qiáng)的抗氧化能力。

[1]曹芬，樊蘭蘭.金花茶研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè)，2013，22(4)：95-96.

[2]牛廣俊，朱思，梁一池，等.金花茶不同部位多糖的測定及體外抗氧化活性研究[J].中國試驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(20)：168-172.

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Optimization of Ultrasound Extraction Process ofCamelliachrysanthaChi based on Antioxidant Activity

NIU Guang-jun1，ZHU Si1，WANG Wei-hua1，WEI Yi-cong1，LIN Na1，CHEN Qing-ying2，LIANG Yi-chi1

(1.FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine(TCM)，F(xiàn)uzhou350122，F(xiàn)ujian，China； 2.CamelliacooperativesofZhanHong，Zhangping364400，F(xiàn)ujian，China)

With the antioxidant activity ofCamelliachrysanthaextracts as indicators，using Box-Benhnken and Response Surface Methodology optimized the ultrasonic extracting procedure，based on the study of the influence of alcohol volume fraction，the ratio of solid to liquid and the extraction duration on the extracts antioxidant ability.Experimental results indicated that the optimum extracting conditions were as following：51% alcohol，treating with ultrasonic for 53 min and the ratio of solid to liquid was 1∶48.Under these conditions，the free radical scavenging rate ofCamelliachrysanthaextracts is 1.5 times of positive control medicine DL-alpha-Tocopherol (0.218 mg·mL-1).Furthermore，the yield of total phenols，flavonoids and saponin were 6.25%，17.18% and 13.26%.

Camelliachrysantha；antioxidant；response surface methodology；ultrasound extraction process

2014-11-08；

2015-01-02

福建省教育廳項(xiàng)目( JA11138)；福建省龍巖市資助項(xiàng)目(201367)

牛廣俊(1990—)，男，山東聊城人，福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院碩士研究生，從事藥材質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)的研究。E-mail：ytdxngj@163.com。

梁一池(1952—)，男，福建福鼎人，福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥材質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)的研究。E-mail：fafulyc@126.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2015.04.003

S685.14

A

1002-7351(2015)04-0013-05