榮俊冬，張迎輝，薛藝敏，王珍添，陳凌艷，鄭郁善，

(1.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學園林學院，福建 福州 350002 )

福建山櫻花總RNA提取方法比較分析

榮俊冬1，張迎輝2，薛藝敏2，王珍添2，陳凌艷2，鄭郁善1，2

(1.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學園林學院，福建 福州 350002 )

以福建山櫻花嫩葉為試驗材料，采用Trizol法、CTAB法、CTAB-LiCl法、百泰克試劑盒法和天根試劑盒法5種方法提取福建山櫻花葉片RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，以微量紫外分光系統(tǒng)檢測總RNA的純度和濃度。結(jié)果表明：Trizol法和天根試劑盒法不適于福建山櫻花葉片RNA的提取；CTAB法和百泰克試劑盒法提取的RNA完整性好，純度及濃度高，但百泰克試劑盒法提取的RNA有DNA污染；CTAB-LiCl法提取的RNA濃度低，且含雜質(zhì)。RT-PCR試驗結(jié)果進一步表明CTAB法提取的RNA能夠用于后續(xù)的分子生物學研究，是福建山櫻花葉片RNA提取的最佳方法。

福建山櫻花；總RNA；提取方法

福建山櫻花(PrunuscampanulataMaxim.)為薔薇科櫻屬落葉喬木，花呈鐘狀下垂開展，顏色濃艷，花期早，每年春節(jié)前后開花，花期長達50 d，極具觀賞價值[1]；且抗逆性強，適應性廣，為園林綠化中不可多得的優(yōu)良鄉(xiāng)土觀賞植物[2]。目前對福建山櫻花及其近緣種的研究多集中在群落學特征、開花生物學、種源遺傳多樣性，以及引種適應區(qū)、繁殖技術、觀賞性評價等方面[3]。而關于福建山櫻花的分子生物學研究則鮮見報道。從分子水平研究基因變化，進行基因調(diào)控和定向分子育種，繁殖和培育出符合人們要求的優(yōu)良品種，是福建山櫻花今后研究的重要內(nèi)容。高質(zhì)量的RNA是Northern雜交、cDNA文庫構(gòu)建、基因表達分析等分子生物學研究的前提和基礎。由于植物組織化學成分的差異，不同植物提取RNA的方法也不盡相同，關于提取植物RNA的文獻很多[4-8]，但福建山櫻花RNA的提取尚未見報道。本文對CTAB、CTAB-LiCl、Trizol、百泰克試劑盒、天根試劑盒5種方法提取的RNA進行比較分析，找出適合提取福建山櫻花RNA的方法，為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為1年生盆栽福建山櫻花嫩葉，現(xiàn)采現(xiàn)用，由福建農(nóng)林大學工業(yè)原料林研究所提供。

1.2 RNA提取方法

1.2.1 Trizol法 嫩葉0.1 g加液氮研磨，轉(zhuǎn)入1 mL預冷的Trizol提取液中，渦旋震蕩2 min；4 ℃、12000 r·min-1離心10 min，吸取上清液；15～30 ℃下靜置5 min，加氯仿200 μL，4 ℃、12000 r·min-1離心15 min，取上清液(此步驟重復1次)；上清液加異丙醇500 μL，顛倒混勻，15～30 ℃靜置10 min，4 ℃、12000 r·min-1離心10 min，棄上清液，留沉淀；加 75%乙醇1 mL懸浮沉淀，4 ℃、7500 r·min-1離心5 min；干燥沉淀，用預熱的RNase-free水溶解沉淀，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CTAB法 嫩葉0.1 g加PVP液氮研磨，轉(zhuǎn)入預熱的CTAB緩沖液1 mL(2% CTAB+100 mmol·L-1Tris-HCl+25 mmol·L-1EDTA+2 mol·L-1NaCl+0.5 g·L-1亞精胺+2% PVP+3% 巰基乙醇)5 min混勻1次；4 ℃、12000 r·min-1離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管中，加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，上下顛倒混勻5 min；4 ℃、12000 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管，加等體積氯仿抽提混勻，冰浴5 min；4 ℃、12000 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管，加2倍體積預冷的無水乙醇，上下顛倒混勻，-20 ℃沉淀2 h；4 ℃、12000 r·min-1離心15 min，棄上清液，用75%乙醇洗滌沉淀；4 ℃、10000 r·min-1離心10 min，棄上清液，干燥沉淀，用預熱的RNase-free水溶解沉淀，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 CTAB-LiCl法 嫩葉0.15 g加PVP液氮研磨，轉(zhuǎn)入預熱的CTAB緩沖液1 mL，劇烈震蕩混勻30 s，65 ℃水浴15 min，每隔2～3 min混勻1次；加氯仿0.4 mL，振蕩10 min使其乳化，4 ℃、10000 r·min-1離心10 min；取上清液于新離心管中(重復上述操作1次)；取上清液于新離心管，加1/4體積的LiCl(10 mol·L-1)，4 ℃過夜(至少6 h)；4 ℃、10000 r·min-1離心15 min，棄上清液，加入250 μL RNase-free水溶解沉淀；加等體積的氯仿抽提2次；加2倍體積的無水乙醇，-20 ℃放置2 h；4 ℃、10000 r·min-1離心15 min，吹干沉淀10 min，RNase-free水溶解，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 百泰克試劑盒法 依照北京百泰克公司通用植物總RNA提取試劑盒(RP3301)說明書步驟進行。

1.2.5 天根試劑盒法 依照北京天根公司RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(DP432)說明書步驟進行。

1.3 RNA質(zhì)量、純度檢測

取RNA提取液1～2 μL，加4 μL RNase-free水稀釋，以1.5 μL溴酚藍染液染色，共7～8 μL點樣電泳。電泳瓊脂糖質(zhì)量分數(shù)為1.2%，電壓150 V，時間20 min。電泳完畢，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察RNA的完整性。取 RNA提取液1 μL，以NanoDrop 2000c微量紫外分光系統(tǒng)進行濃度及純度檢測，記錄所得RNA的濃度，OD260/OD280、OD260/OD230值。

1.4 RT-PCR檢測

參照Clontech公司的說明書對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄及雙鏈合成，取第一鏈2 μL作為模板，反應條件為95 ℃、1 min；95 ℃、15 s，65 ℃、30 s，68 ℃、6 min，18個循環(huán)；4 ℃結(jié)束反應。取PCR產(chǎn)物3 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的純度與質(zhì)量濃度

以溶解RNA相應的DEPC水作空白對照進行調(diào)零，在NanoDrop 2003c上測得RNA質(zhì)量濃度及純度(表1)。

純RNA 的OD260/OD280值為 2.0，當OD260/OD280<1.8時，表明蛋白質(zhì)或其它有機物的污染比較明顯；當OD260/OD280>2.2時，說明 RNA 已經(jīng)水解成單核苷酸了。一般OD260/OD280值在1.8～2.1之間。OD260/OD230值若小于1.6，表明RNA有鹽類等雜質(zhì)的干擾；OD260/OD230大于1.6，RNA純度較好。由表1可知，CTAB法、CTAB-LiCl法和百泰克試劑盒法提取的RNA的純度均符合要求，但CTAB-LiCl法RNA質(zhì)量濃度較低。Trizol法和天根試劑盒法提取的RNA，OD260/OD280、OD260/OD230值極低，蛋白和鹽分殘留嚴重，不適用于福建山櫻花RNA的提取。

2.2 總RNA的質(zhì)量

將5種方法提取的福建山櫻花總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，只有CTAB法、CTAB-LiCl法和百泰克試劑盒法提取的RNA電泳有條帶出現(xiàn)，而Trizol法和天根試劑盒法提取的RNA未出現(xiàn)條帶。CTAB法提取的RNA，其28 s條帶的亮度幾乎是18 s條帶亮度的2倍，且?guī)缀鯖]有降解及DNA的污染，提取效果好(圖1A)；CTAB-LiCl法提取的RNA電泳條帶略暗，18 s處條帶不夠清晰，說明含有少量雜質(zhì)，由于LiCl主要是沉淀大分子RNA，因而5 s條帶不明顯(圖1B)；百泰克試劑盒法提取RNA，電泳條帶清晰，幾乎無降解，但DNA污染比較明顯(圖1C)，如果要進行下一步實驗，必須先用DNase進行處理。

表1 不同方法提取的RNA純度、質(zhì)量濃度

圖1 不同方法提取的RNA電泳圖圖2 RT?PCR產(chǎn)物cDNA電泳結(jié)果

2.3 3種福建山櫻花總RNA提取方法優(yōu)缺點比較

3種福建山櫻花總RNA提取方法的優(yōu)缺點見表2。CTAB法提取的RNA能夠滿足后續(xù)分子生物學實驗的要求，但需時較長，步驟繁瑣，試劑毒性大，操作時需要加倍小心；百泰克通用植物總RNA提取試劑盒若能充分去除DNA的干擾，也能達到預期目的，而且操作時間短，僅需30 min就能完成，但費用較高；CTAB-LiCl法操作時間最長，RNA濃度低且含有少量雜質(zhì)，盡管可以通過加大樣品量和細心操作來解決，但不建議使用。

表2 3種RNA提取方法的優(yōu)缺點

2.4 RT-PCR分析

對CTAB法提取的RNA使用In-Fusion SMART cDNA文庫構(gòu)建試劑盒進行cDNA合成。從擴增結(jié)果(圖2)可以看出，擴增得到的雙鏈cDNA片段大小的分布范圍是0.2～3 kb，大部分片段主要集中在0.4～1.5 kb之間，表明CTAB法提取的RNA可以用于后續(xù)的分子生物學研究。

3 結(jié)論與討論

Trizol法簡單方便，耗時較短，許多植物用Trizol法成功提取了RNA[9-10]，但此法不適合福建山櫻花RNA的提取，可能是因為福建山櫻花葉片多糖、多酚、次生代謝物質(zhì)含量較高，Trizol類方法無法防止多糖多酚對RNA/DNA分相的干擾，會殘留大量多糖、多酚或其他次級代謝產(chǎn)物。前人的研究結(jié)果也證實了Trizol法不適用于次生代謝物質(zhì)多的植物[11-13]。天根試劑盒法的裂解液主要成分是異硫氰酸胍，是用胍鹽促使核糖核酸酶變性而抑制其活性，從試驗結(jié)果看，天根試劑盒法與Trizol法一樣無法成功提取出RNA。

CTAB是一種強變性劑，被廣泛應用于植物核酸提取，也被認為是適用于多糖、多酚類植物RNA提取的方法[14-16]，福建山櫻花的同科植物蘋果、桃、紫葉李等通過用改良的CTAB法均成功獲得了高質(zhì)量的RNA[17-19]。在CTAB法中協(xié)同使用了PVP和β-巰基乙醇，PVP作為多酚化合物的螯合劑，具有很強的結(jié)合酚的能力，β-巰基乙醇作為強還原劑也能防止多酚的氧化，二者協(xié)同作用有效抑制了酚類物質(zhì)對RNA提取的影響[20]；提取緩沖液中的亞精胺可以抑制核糖核酸酶的活性。提取過程中使用酚、氯仿、異戊醇的抽提液結(jié)合長時間高速離心可以有效抽提去除蛋白質(zhì)，再加入氯仿溶解脂肪并通過低速離心去除有機相從而去除脂肪。CTAB法耗時相對百泰克試劑盒法較長，但經(jīng)濟實用。

CTAB-LiCl法抽提步驟多，時間長，對于LiCl沉淀過后的產(chǎn)物仍需要用氯仿進行2次處理，2次沉淀，RNA很容易經(jīng)多次抽提后損失殆盡，總的得率不高且降解度很大，不利于下一步試驗的進行。

百泰克試劑盒法是一種專門用于RNA提取的試劑盒，采用柱式純化的方式進行，操作簡便快捷，提取的RNA的濃度、完整性均較高，但有DNA污染，若要獲得高純度的RNA，還需加入DNase 處理，與CTAB法相比，成本較高。

綜合RNA的純度、產(chǎn)量及經(jīng)濟方面考慮，CTAB法為福建山櫻花葉片RNA提取的最佳方法，因此可采用CTAB法所提總RNA進行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄試驗。

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Comparison Study of Different Methods for total RNA Isolation fromPrunuscampanulataMaxim.

RONG Jun-dong1，ZHANG Ying-hui2，Xue Yi-min2，WANG Zhen-tian2，CHEN Ling-yan2，ZHENG Yu-shan1，2

(1.CollegeofForestry，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou350002，F(xiàn)ujian，China；2.CollegeofLandscapeArchitecture，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou350002，F(xiàn)ujian，China)

The performances of five extraction methods of total RNA which contain Trizol method，CTAB method，CTAB-LiCl method，Bio Teke RNApure Total RNA Plant kit and TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit fromPrunuscampanulataMaxim.were compared in this research.The intrgrity of RNA were tested by agarose gel electrophoresis，the yields and quality of RNA were tested by micro ultraviolet spectrophotometer.It showed that both of Trizol method and TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit weren’t suitable for total RNA isolation from leaves of P.campanulata.The CTAB and Bio Teke RNApure Total RNA Plant kit method could provide a high integrity and high yields total RNA，but there were traces of DNA pollution with Bio Teke RNApure Total RNA Plant kit.A lower total RNA yield and degradeted 18s RNA on gel electrophoresis were found in CTAB-LiCl method.RT-PCR amplification also showed that the quality of RNA isolated from CTAB method can meet the demands of molecular biology experiments.

Prunuscampanulata；total RNA；extraction methods

2014-03-03；

2014-04-25

福建省科技重大專項專題基金(2007SZ0001-8)

榮俊冬(1979—)，男，山東文登人，福建農(nóng)林大學林學院助理研究員，從事森林培育研究。E-mail：rongjd@126.com。

鄭郁善(1960—)，男，福建永泰人，福建農(nóng)林大學教授，博士生導師，從事森林培育研究。E-mail：zys1960@163.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2015.01.015

S685.99；Q522

A

1002-7351(2015)01-0073-04