聶舒　李平　朱紅梅　溫海（上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海200003）

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與新生隱球菌GXM作用后基因表達(dá)譜分析

聶舒李平朱紅梅溫海
（上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海200003）

目的探索新生隱球菌GXM能否影響腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究隱球菌嗜中樞性的分子機(jī)制提供線(xiàn)索。方法使用Roche NimbleGen 12×135K小鼠基因表達(dá)譜芯片，篩選小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd．3與不同濃度新生隱球菌GXM作用后差異表達(dá)的基因；結(jié)合基因本體論（Gene Ontology），使用topGO進(jìn)行差異基因GO分析，結(jié)合GO語(yǔ)義挖掘與隱球菌侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)能力相關(guān)的差異表達(dá)基因的信息；采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)重要基因PIK3C2G和ADAMDEC1的表達(dá)水平變化加以驗(yàn)證。結(jié)果bEnd．3細(xì)胞與新生隱球菌GXM作用前后基因表達(dá)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組GXM（90 μg／m）組總共有402個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，296個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，GXM（180 μg／m）組總共有421個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，564個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架、磷酸肌醇?3?激酶活化、1?磷酸肌醇?3?激酶活化、細(xì)胞緊密連接等生物過(guò)程差異表達(dá)基因較為富集；對(duì)PIK3C2G基因和ADAMDEC1基因表達(dá)水平變化進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果與芯片結(jié)果一致，基因表達(dá)水平不同程度上升，且與GXM濃度正相關(guān)。結(jié)論新生隱球菌GXM能夠影響腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)，PIK3C2G基因、ADAM?DEC1基因表達(dá)上調(diào)可能和隱球菌穿越血腦屏障有關(guān)。

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞；新生隱球菌；GXM；基因芯片

［Chin J Mycol，2015，10（2）：84?87］

新生隱球菌是一種環(huán)境腐生菌，存在于人們?nèi)粘５纳钪?，屬于?dān)子菌門(mén)，廣泛分布于全世界的土壤中，特別是鴿子糞便污染的土壤。長(zhǎng)久以來(lái)認(rèn)為新生隱球菌僅為機(jī)會(huì)致病菌，免疫受損和或免疫不全人群易感，但近年來(lái)國(guó)內(nèi)外回顧性分析認(rèn)為新生隱球菌哥特變種，免疫正常人群同樣易感［1?2］。

隨著艾滋病全球形勢(shì)的日益嚴(yán)峻，器官移植患者的增多，新生隱球菌感染受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。HIV患者并發(fā)急性隱球菌性腦膜腦炎后給予積極的抗真菌治療3個(gè)月內(nèi)死亡率仍接近20%，入院后不予特定抗真菌治療2周內(nèi)的死亡率高達(dá)100%［3］。器官移植患者中約有2．8%發(fā)生侵襲性隱球菌感染［4］，52%～61%患者表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累和播散性感染。播散性隱球菌病感染具有顯著的嗜中樞性，約九成以上侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)［5］，引起隱球菌性腦膜腦炎，一旦發(fā)生中樞系統(tǒng)感染，死亡率高達(dá)40%［3］。隱球菌侵襲中樞系統(tǒng)需要跨越我們重要的屏障系統(tǒng)血腦屏障，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障最重要的細(xì)胞。前期研究發(fā)現(xiàn)隱球菌能夠影響腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞基因的表達(dá)，為進(jìn)一步探索隱球菌侵襲中樞系統(tǒng)機(jī)制，我們將隱球菌莢膜最主要成分葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖（glucuronoxylomannan，GXM）與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)，分析作用前后在整體基因表達(dá)水平上變化，并對(duì)重要差異表達(dá)基因加以驗(yàn)證。

1　材料和方法

1．1材料

bEnd．3細(xì)胞系：小鼠永生化腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。購(gòu)自ATCC（美國(guó)模式菌收集中心）。新生隱球菌B3501（血清D型）：中國(guó)醫(yī)學(xué)真菌保藏中心隱球菌專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室。YPD液體培養(yǎng)基（1 000mL）：分別稱(chēng)取1%酵母膏即為10 g，2%胰蛋白胨即為20 g，2%葡萄糖即為20 g，加入適量去離子水充分溶解，定容到1 000mL，121℃高壓滅菌處理約20min，冷卻至室溫后，放4℃冰箱保存?zhèn)溆?；SDA固體培養(yǎng)基（1 000mL）：分別稱(chēng)量1%蛋白胨即10 g，4%葡萄糖即40 g，1．5%瓊脂，加適量去離子水充分溶解上述物質(zhì)，定容至1 000mL，115℃滅菌處理30min，隨后在冷卻至60℃時(shí)，加入氯霉素1 g（比例為1／1 000），充分混勻后即刻鋪板，鋪板后待培養(yǎng)基冷卻至室溫后，存于4℃冰箱備用；YNB液體培養(yǎng)基：提前加50 IU／mL的雙抗（即為鏈霉素＋青霉素），放4℃冰箱保存?zhèn)溆?；bEnd．3細(xì)胞系培養(yǎng)基

（50mL）：41．5mL DMEM，1mL鏈霉素＋青霉素；7．5mL FBS，放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2主要試劑

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、酵母氮基礎(chǔ)（YNB）購(gòu)自Sigma，CTAB配制成0．3%的水溶液置常溫備用。酵母提取物、蛋白胨、氯霉素、瓊脂糖、NaCl、葡萄糖均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭琓rizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自BIOTNT公司。12×135K小鼠基因表達(dá)譜芯片購(gòu)自Roche NimbleGen，并由上海康成生物協(xié)助完成檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析。

1．3方法

隱球菌莢膜多糖GXM的純化將B3501接種至1 L YNB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4 d，9 000 r／min離心收集上清，緩慢加入3倍體積的無(wú)水乙醇，出現(xiàn)乳狀沉淀，搖晃均勻后置4℃，過(guò)夜。將CTAB稀釋為0．3%水溶液備用。次日棄上清，盡量風(fēng)干沉淀。加18mL水溶解沉淀（必要時(shí)需攪拌過(guò)夜），此時(shí)形成稠溶液，為GXM及GalXM混合物。加入2mL 2 mol／L NaCl，然后緩慢加入0．3%CTAB水溶液（約1mL／min），邊加邊攪拌，CTAB總用量為多糖含量的3倍，即100 mg多糖溶液應(yīng)加入CTAB 100mL（＝300 mg CTAB）。實(shí)際操作中為確保GXM被完全沉淀，CTAB用量稍高于理論值，終點(diǎn)為無(wú)新的沉淀產(chǎn)生。9 000 r／min離心10min棄上清，沉淀使用10%乙醇洗一遍，風(fēng)干，此為CTAB．GXM復(fù)合物。然后加12mL 1 mol／L的NaCl溶解沉淀，再加入2．5倍體積無(wú)水乙醇沉淀溶液中的GXM，此時(shí)CTAB仍存留于溶液中，9 000 r／min高速離心30min，收集沉淀（GXM），用2 mol／L的NaCl溶解沉淀，溶解需過(guò)夜或數(shù)日，此時(shí)會(huì)形成極其稠溶液，似甘油。取GXM溶液加至10 KD的透析袋中，密封，將透析袋置于1 M NaCl于4℃透析1 d，再將透析液換成雙蒸水透析1周，每天換液，直至形成清亮的溶液，最后再用PBS透析1 d，將GXM溶液置換成PBS，過(guò)內(nèi)毒素清除柱去除內(nèi)毒素，酚硫酸法測(cè)量濃度后存于80℃?zhèn)溆谩?/p>

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd．3培養(yǎng)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的bEnd．3細(xì)胞PBS洗兩遍，胰蛋白酶（含ED?TA）消化23后加培養(yǎng)基（含血清）終止，收集細(xì)胞，使用含有15%FBS的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整到1106個(gè)／mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶1mL。為了實(shí)驗(yàn)的平行性，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，即同一瓶細(xì)胞傳瓶，分別標(biāo)記為區(qū)組一（標(biāo)1、2、3），區(qū)組二（標(biāo)4、5、6）以及區(qū)組三（標(biāo)7、8、9），區(qū)組內(nèi)的瓶細(xì)胞隨機(jī)數(shù)表法進(jìn)入實(shí)驗(yàn)組（B組，90 μg／mL GXM）、實(shí)驗(yàn)組（C組，180 μg／mL GXM）及對(duì)照組（A組，空白組），實(shí)驗(yàn)具體分組見(jiàn)表1。次日換液，并PBS洗次，去除漂浮的死亡細(xì)胞；待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)；大約2 d后，實(shí)驗(yàn)組B和C組中分別加入提前制備好的含90 μg／mL GXM、180 μg／mL GXM細(xì)胞培養(yǎng)基，并設(shè)空白對(duì)照A組，加不含GXM的細(xì)胞培養(yǎng)基共同培養(yǎng)；相互作用12 d后，分別用5mL PBS洗2次，并盡量吸干殘余的PBS，貼壁細(xì)胞用于抽提總RNA。

表1　實(shí)驗(yàn)分組情況Tab．1　Grouping of experiment

Trizol法抽提總RNA將上述準(zhǔn)備好的細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入1mL Trizol試劑，反復(fù)抽吸吹打，收集細(xì)胞裂解液至離心管，送康成公司檢測(cè)。另取經(jīng)過(guò)同樣處理的裂解液提取RNA，進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，裂解液中加入0．2mL氯仿，混勻，室溫靜置15min。4℃12 000 r／min離心15min，小心吸取上層水相至另一離心管，加入0．5mL異丙醇室溫放置5～10min，4℃12 000 r／min離心10min，棄上清，75%乙醇洗滌1遍后風(fēng)干。50μL雙蒸水溶解樣本，60℃水浴5～10min，凍存?zhèn)溆谩?/p>

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA反轉(zhuǎn)錄采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（BIOTNT公司）。取2μg總RNA，再加入DEPCddH2O至11μL混勻，加入50 μM Oligo（dT）12～18μL，溫和混勻，離心。置70℃中持續(xù)加熱，立即插入冰浴中大于1min。然后在每管中（原來(lái)有12μL）加入RT反應(yīng)液13μL，混合均勻，總體積25μL（反應(yīng)液：M?MLV 5×Reaction Buffer 5μL，10 mM dNT?Pmix 1．25μL，Recombinant RNasin 25μL，M?MLV 200 units，DEPC H2O加至13μL）。42℃反應(yīng)60min后，cDNA產(chǎn)物置于?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)時(shí)熒光定量PCR熒光定量PCR采用Re?altime PCR試劑盒（BioTNT公司），定量PCR Premix試劑混合物10μL，引物各2μL，cDNA模板1μL，加去離子水至20μL。PCR反應(yīng)條件：95℃5min→95℃5min→60℃30min→溶解曲線(xiàn)分析（40個(gè)循環(huán)）。表達(dá)水平以2?△△Ct表示。引物序列如下：PIK3C2G上游：5＇TGC CTG ATG CTG TAA CCC T 3＇，下游：5＇GTT GTG CTG ACT GAA CCA C 3＇，產(chǎn)物TM 83．6℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度98 bp；ADAMDEC1上游：5＇TAC CGT CAG CCG TTC TCA T 3＇，下游：5＇GTC ACA CTC TTC TCC CAC A 3＇，產(chǎn)物TM 82．7℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度136 bp。

2　結(jié)　果

2．1基因芯片初步篩選結(jié)果

將所有基因表達(dá)譜芯片目標(biāo)基因表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后，實(shí)驗(yàn)組B組、C組腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞全基因組轉(zhuǎn)錄水平分別與空白對(duì)照組A組做橫向比較，根據(jù)Benjamini Hochberg FDR方法［6］得到修正的P值（即FDR）進(jìn)行差異基因篩選（Fold Change＞＝2．0，F(xiàn)DR＜＝0．05）。篩選獲得B組總共有402個(gè)基因上調(diào)，296個(gè)基因下調(diào)；C組總共有421個(gè)基因上調(diào)，564個(gè)基因下調(diào)（見(jiàn)圖1）。通過(guò)使用topGO［7］進(jìn)行差異基因的GO分析以推斷差異表達(dá)基因參與的分子功能，未一一列舉。標(biāo)準(zhǔn)富集排序后發(fā)現(xiàn)TOP10的類(lèi)目主要為細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架、磷酸肌醇?3?激酶活化、1?磷酸肌醇?3?激酶活化、細(xì)胞緊密連接。

2．2熒光定量PCR驗(yàn)證ADAMDEC1基因、PIK3C2G基因的表達(dá)

熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組ADAMDEC1基因、PIK3C2G基因表達(dá)水平較空白對(duì)照組A組均明顯上調(diào)（見(jiàn)圖2）。

3　討　論

隱球菌侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)首先需要穿透血腦屏障，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是維持血腦屏障功能最重要的細(xì)胞。前期研究我們發(fā)現(xiàn)菌體本身能夠影響腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)，并驗(yàn)證了基因CDH10、基因SELENBP1表達(dá)明顯上調(diào)。隱球菌的顯著特點(diǎn)是菌體外包被了厚莢膜，其莢膜主要由葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖（GXM）、半乳糖木糖甘露聚糖（GalXM）和甘露糖蛋白（MP）組成，其中GXM占莢膜多糖總質(zhì)量的88%以上。

本研究將不同濃度GXM與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)12后篩選基因表達(dá)譜中差異表達(dá)的基因，采用標(biāo)準(zhǔn)富集法進(jìn)行GO分析［7］，發(fā)現(xiàn)GXM與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架、磷酸肌醇?3?激酶活化、1?磷酸肌醇?3?激酶活化、細(xì)胞連接等生物過(guò)程的基因表達(dá)變化相關(guān)。我們對(duì)表達(dá)上升較為明顯、功能較為重要的磷酸肌醇3激酶家族的PIK3C2G基因以及解聚素金屬蛋白酶家族的AD?AMDEC1基因采用RT?PCR技術(shù)進(jìn)一步加以驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)上調(diào)明顯，另一方面也相應(yīng)驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性。

圖1　差異基因火山圖　圖2　GXM作用12 h后bEnd．3細(xì)胞基因ADAMDEC1、PIK3C2G表達(dá)水平變化Fig．1　Clustering analyzing of differential genes　Fig．2　ADAMDEC1，PIK3C2G gene expression changes of bEnd．3 cell after co?culturing with differ?ent concentrations of GXM for 12 hours

PIK3C2G基因位于12號(hào)染色體12p12，編碼的產(chǎn)物為PI3K?C2γ，屬于磷酸肌醇3激酶家族（phos?phoinositide 3?kinase family，PI3K家族），PI3K家族在信號(hào)通路中扮演重要角色，參與細(xì)胞增殖、致瘤性轉(zhuǎn)換、細(xì)胞存活、細(xì)胞移行、細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等重要生物過(guò)程。PIK3C2G基因編碼產(chǎn)物PI3K?C2γ是PI3Ks家族classⅡ中的C2γ亞型［9?10］。目前對(duì)PI3K家族的研究主要集中在Ⅰ類(lèi)的催化和調(diào)節(jié)功能上，對(duì)classⅡ、classⅢ及classⅣ的了解并不多。GO國(guó)際功能分類(lèi)體系提示其在細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)通路、磷脂酸代謝過(guò)程、磷脂酰肌醇生物合成過(guò)程、趨化作用、磷脂酰肌醇磷酸化等過(guò)程中均扮演一定角色，進(jìn)一步查閱KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，可以發(fā)現(xiàn)其也參與調(diào)整肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架通路［11］。既往有研究發(fā)現(xiàn)隱球菌與宿主腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用過(guò)程中，細(xì)胞表面能夠形成微絨毛樣突起［12］，提示涉及宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架結(jié)構(gòu)的改變。提示我們PIK3C2G基因的上調(diào)可能與隱球菌穿越血腦屏障能力有關(guān)，需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

盡管1997年研究者就發(fā)現(xiàn)了ADAMDEC1基因，但對(duì)它的了解還很局限。ADAMDEC1基因位于染色體8p21．2上，其編碼的蛋白decysin1是解聚素金屬蛋白酶家族（A Disintergrin And Metalloprotein? ase，ADAM）的一員。Decysin1具有蛋白酶活性，被認(rèn)為可能在樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟過(guò)程中有重要作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，隱球菌可利用宿主血液中的蛋白水解酶破壞血管完整性［13］，進(jìn)而破壞血腦屏障的完整性，進(jìn)一步穿越血腦屏障，推測(cè)金屬蛋白酶decysin1表達(dá)的上調(diào)可能與隱球菌侵襲內(nèi)皮細(xì)胞能力有關(guān)，其功能和作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

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［本文編輯］王飛

Gene expression profiling analysis of mouse brain microvascular endothelial cells incubated with glycuro?noxylomannan of Cryptococcus neoformans

NIE Shu，LI Ping，ZHU Hong?mei，WEN Hai
（Shanghai Key Laboratory of Molecular Medical Mycology and PLA Key Laboratory of Fungal Diseases，Department of Dermatology，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China）

ObjectiveTo explore whether cryptococcal capsular polysaccharide GXM can influence the gene expression of cere?brovascular endothelial cells and providing clues for further study of the molecular mechanism of cryptococcus addicted to central．

MethodsThe Mouse 12×135K Gene Expression Array manufactured by Roche NimbleGen was used to identify the differentially ex?pressed genes of bEnd．3 cells after co?culturing with GXM in different levels．TopGO method is used to analyze the differentially ex?pressed genes．We analyze differences in gene function with the GO classification function and find information about the literature da?ta．The changes of some important genes were found and then validated by RT?PCR．ResultsAfter comparison，we got 698 differenti?ally expressed genes，including 402 up?regulated and 296 down?regulated in the GXM（90 μg／mL）group and 985 differentially genes，including 421 up?regulated and 564 down?regulated in the GXM（180 μg／mL）group．Cryptococcal capsular polysaccharide GXM can regulate vascular endothelial cell gene expression．Genes relating to tight junction，cell transduction，cytoskeleton，metabo?lism of cell membrane componentsetc have been impacted．Considering literature and GO analysis results，we selected gene PIK3C2G and gene ADAMDEC1 and validated their expression levels by RT?PCR．The results were in line with the microarray data．Conclu?sionsCryptococcal capsular polysaccharide GXM can influence the gene expression of cerebrovascular endothelial cells Increase in genetic PIK3C2G，ADAMDEC1 may relate to the ability of cryptococcus invading blood brain barrier．

brain microvascular endothelial cells；C．neoformans；GXM；Gene expression profilinganalysis

R 379．5

A

1673?3827（2015）10?0084?04

國(guó)家自然科學(xué)基金（31470252，81271800）

聶舒，女（漢族），碩士研究生在讀．E?mail：nieshu1989＠foxmail．com

溫海，E?mail：wenhai98＠sohu．com；朱紅梅，E?mail：hmzhu＿cn＠163．com

2015?01?26