周兆婧　孟云芳　趙靜宇　桑軍軍　張超　法振宗　方偉　廖萬清（．上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海00003；．上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海00003；3．上海市皮膚病醫(yī)院，上海00050）

新生隱球菌轉(zhuǎn)錄共激活因子MBF1基因的鑒定與敲除

周兆婧1，2孟云芳1，2趙靜宇1，3桑軍軍1張超1法振宗1方偉2廖萬清1，2
（1．上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200003；2．上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海200003；3．上海市皮膚病醫(yī)院，上海200050）

目的構(gòu)建新生隱球菌轉(zhuǎn)錄共激活因子MBF1基因缺陷菌株。方法采用套疊PCR方法，構(gòu)建含有抗性基因NEO以及靶基因上下游同源DNA片段的基因敲除框，通過基因槍將重組片段轉(zhuǎn)化入新生隱球菌，應(yīng)用PCR篩選和DNA序列測(cè)序方法對(duì)基因突變株進(jìn)行鑒定與驗(yàn)證。結(jié)果成功構(gòu)建了新生隱球菌基因突變株mbf1△。結(jié)論通過基因突變株mbf1△的構(gòu)建，為深入研究新生隱球菌轉(zhuǎn)錄輔助因子Mbf1的功能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

新生隱球菌；致病機(jī)制；基因敲除

［Chin J Mycol，2015，10（2）：80?83］

隱球菌?。–ryptococcosis）是臨床上最重要的侵襲性真菌感染之一，其主要致病病原體為新生隱球菌（Cryptococcus neoformans）和格特隱球菌（Cryptococcus gatti），主要通過孢子吸入、直接接種或血行播散感染免疫功能抑制的人群，可引發(fā)具有致命威脅的腦膜腦炎。近年來AIDS蔓延擴(kuò)散，細(xì)胞／器官移植、化療、免疫抑制劑以及各類置管等侵襲性診療技術(shù)進(jìn)一步推廣，隱球菌病在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定的上升趨勢(shì)，據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，每年約600 000例患者死于隱球菌感染［1?2］。

隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，隱球菌作為一種模式病原真菌應(yīng)用于分子診斷、致病機(jī)制、治療新靶點(diǎn)的研究［3?5］。多蛋白橋接因子1（Multiprotein bridging factor1，Mbf1）是真核生物中普遍存在的一種轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白，主要通過特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、連接TATA盒從而激活基因轉(zhuǎn)錄，對(duì)真核生物基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮十分重要的作用［6?7］。目前已證實(shí)，Mbf1可能參與調(diào)控真核細(xì)胞激素分泌、脂類代謝、組氨酸代謝等多種生物學(xué)過程，其生物功能可能通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子Gcn4發(fā)揮作用［7］。在此基礎(chǔ)上，本研究以新生隱球菌為背景菌株，通過同源重組的方法構(gòu)建新生隱球菌MBF1基因突變株，為進(jìn)一步研究其對(duì)病原真菌的生長(zhǎng)和毒力調(diào)控作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1．1材料

菌株與質(zhì)粒新生隱球菌格魯比變種（C．neoformans var．grubii）標(biāo)準(zhǔn)株H99、質(zhì)粒pJAF?1（含有報(bào)告基因NEO）均由本實(shí)驗(yàn)室提供［8］。

培養(yǎng)基與主要試劑以YPD為酵母細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入1 mol／L山梨醇、200 mg／L遺傳霉素G418（Sigma?aldrich公司）分別作為隱球菌的基因敲除保護(hù)培養(yǎng)基和抗性篩選培養(yǎng)基。DNA聚合酶（EasyTaq、FastPfu等）、電泳凝膠回收試劑盒、酵母基因組抽提試劑盒等均購(gòu)自TransGen Biotech公司。

主要儀器電泳凝膠成像系統(tǒng)、BioRad基因槍、PCR儀、微量分光光度計(jì)等儀器設(shè)備均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1．2實(shí)驗(yàn)方法

生物信息學(xué)分析從隱球菌（www．broadin?stitute．org／annotation／genome／cryptococcus＿neofor?mans）基因組數(shù)據(jù)庫(kù)以及NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（www．ncbi．nlm．nih．gov／protein）獲得新生隱球菌以及其他真核生物物種轉(zhuǎn)錄共激活因子Mbf1的氨基酸序列。應(yīng)用在線生物信息學(xué)軟件tblastn對(duì)比不同生物種間Mbf1的蛋白差異，應(yīng)用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／pfam．sanger．a(chǎn)c．uk／）對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，同時(shí)應(yīng)用DNASTAR軟件中的Clustal W alignment軟件對(duì)重要真核生物中的Mbf1同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析。

構(gòu)建基因重組突變框以H99基因組為模板，根據(jù)新生隱球菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的MBF1基因序列（CNAG＿04637）設(shè)計(jì)上下游的兩對(duì)擴(kuò)增引物M5F／M5R和M3F／M3R（見表1），合成同源基因片段5?FR、3?FR片段；以質(zhì)粒pJAF?1 DNA為模板，根據(jù)引物M13F、M13R（詳見表1）合成抗性基因NEO片段。將上述純化后的基因片段等摩爾濃度為模板，應(yīng)用引物M5F、M3R合成基因同源重組突變框。PCR反應(yīng)條件：94℃5min，94℃30 s， 55℃30 s，72℃1min（1 kb／min），35個(gè)循環(huán)后72℃10min。

表1　引物列表Tab．1　Primers list

新生隱球菌MBF1的基因敲除取新生隱球菌H99單克隆接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃搖菌16～18 h，無菌雙蒸水洗脫2遍后，用無菌玻璃珠均勻涂布于保護(hù)性培養(yǎng)基平皿（YPD＋1M山梨醇）上作為感受態(tài)細(xì)胞。將純化后的基因重組片段經(jīng)基因槍轉(zhuǎn)入新生隱球菌感受態(tài)細(xì)胞中，30℃孵育4 h后轉(zhuǎn)至抗性培養(yǎng)基平皿（YPD＋G418）中篩選孵育［9］。同時(shí)，以未轉(zhuǎn)化的H99感受態(tài)細(xì)胞涂布于抗性培養(yǎng)基上作為陰性對(duì)照。

陽性克隆的篩選與驗(yàn)證從篩選抗性平板中挑取單克隆，應(yīng)用酵母基因組DNA提取試劑盒抽提其DNA，分別應(yīng)用兩對(duì)引物M?DP?F／NEO?R和M?DP?R／NEO?F進(jìn)行PCR驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，取電泳條帶正確的陽性克隆子擴(kuò)增片段進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證。

2　結(jié)　果

2．1生物信息學(xué)分析

新生隱球菌轉(zhuǎn)錄共激活因子Mbf1包含150個(gè)氨基酸，主要由MBF1（Multiprotein bridging factor 1）和HTH3（Helix?turn?helix）兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)不同真核生物物種的Mbf1同源蛋白之間結(jié)構(gòu)高度相似，均由類似的結(jié)構(gòu)域組成（見圖1）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析進(jìn)一步提示Mbf1在不同真核物種進(jìn)化過程中存在較高的結(jié)構(gòu)保守性，這種進(jìn)化上的一致性為我們預(yù)測(cè)并比較不同真核生物轉(zhuǎn)錄共激活因子Mbf1的功能提供了理論依據(jù)（見圖2）。

2．2基因重組突變框的構(gòu)建

我們首先利用CTAB法獲得新生隱球菌H99基因組［8］，以此為模板擴(kuò)增目的基因MBF1上、下游同源的核苷酸序列片段（5?FR，929 bp；3?FR，926 bp），從質(zhì)粒載體pJAF中獲得抗性基因NEO（2 098 bp）片段，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果（見圖3），電泳條帶完全符合預(yù)期。將上述PCR產(chǎn)物電泳凝膠回收，二次PCR反應(yīng)獲得靶基因MBF1的同源重組突變框（KO，3 953 bp），PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3，完全符合預(yù)期，提示我們基因敲除框構(gòu)建成功。

2．3基因敲除與驗(yàn)證

將上述重組DNA片段經(jīng)基因槍轉(zhuǎn)化入新生隱球菌的感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗性選擇培養(yǎng)基篩選后獲得十余個(gè)陽性克隆菌落，陰性對(duì)照無菌落生長(zhǎng)，提示我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。隨機(jī)挑選4個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，提取其基因組后行PCR初步篩選鑒定，分別使用引物M?DP?F／NEO?R（2 151 bp）和M?DP?R／NEO?F（2 840 bp），擴(kuò)增片段電泳結(jié)果完全符合預(yù)期（見圖4），將其中篩選正確的菌株相應(yīng)的PCR產(chǎn)物分別送DNA測(cè)序，測(cè)序序列進(jìn)行核苷酸比對(duì)后完全正確（結(jié)果未展示），提示我們新生隱球菌基因突變株mbf1Δ（mbf1：：NEO）構(gòu)建完全正確。

3　討　論

MBF1是真核生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的一種高度保守的轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過橋接轉(zhuǎn)錄因子DNA序列結(jié)合區(qū)和TATA盒耦聯(lián)蛋白實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而調(diào)節(jié)真核細(xì)胞的各種生物學(xué)活動(dòng)［7］。通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)Mbf1主要包含N末端的MBF1結(jié)構(gòu)域（結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子）和C末端的HTH結(jié)構(gòu)域（結(jié)合TATA盒耦聯(lián)蛋白），后者包含有4個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，和1個(gè)保守的尾部結(jié)構(gòu)，考慮可能與其蛋白保守性密切相關(guān)［10］。

在功能研究方面，Mbf1蛋白在古菌、植物中研究較多，主要參與調(diào)控氧化應(yīng)激應(yīng)答、高溫耐受以及生長(zhǎng)發(fā)育等多種生物學(xué)過程［11］。在擬南芥中，Mbf1基因沉默可導(dǎo)致種子發(fā)芽減少、植株生長(zhǎng)矮小［12］，而轉(zhuǎn)錄共激活因子基因過表達(dá)后則對(duì)高溫、高滲和（或）細(xì)菌感染顯示了更強(qiáng)的耐受力［13?14］。真菌領(lǐng)域Mbf1功能機(jī)制研究相對(duì)較少，鑒于其蛋白結(jié)構(gòu)上的高度保守性，我們?cè)O(shè)想Mbf1可能對(duì)隱球菌的應(yīng)激應(yīng)答、有性繁殖等生物學(xué)過程具有類似的調(diào)控功能。本研究已成功構(gòu)建基因突變株mbf1Δ，后續(xù)的功能機(jī)制研究將可進(jìn)一步解決這一疑問。

關(guān)于隱球菌未知蛋白的功能機(jī)制研究，常用的分子生物學(xué)方法主要有基因敲除、基因沉默（RNA干擾）以及土壤根瘤桿菌（Agrobacterium tumefa?ciens）轉(zhuǎn)化等方法，其中以基因敲除最為常見?；蚯贸?，主要利用基因同源重組原理，通過電轉(zhuǎn)化或高壓氦氣轟擊等方法實(shí)現(xiàn)靶基因的定向置換與突變。在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用套疊PCR法構(gòu)建基因突變框，將重組PCR片段利用基因槍轉(zhuǎn)入隱球菌細(xì)胞內(nèi)，相較于應(yīng)用重組質(zhì)粒構(gòu)建同源片段［15?16］，轉(zhuǎn)化效率更高、異位整合錯(cuò)配發(fā)生率更低、對(duì)靶基因鄰近基因的表達(dá)影響更?。?7］。與此同時(shí)，mbf1Δ突變株的成功構(gòu)建，進(jìn)一步提示該基因并非新生隱球菌的必需基因，并為后續(xù)進(jìn)一步探索其在新生隱球菌的毒力因子應(yīng)答、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學(xué)過程的功能影響奠定了重要的基礎(chǔ)。

圖1　不同真核生物種Mbf1蛋白結(jié)構(gòu)域的生物信息學(xué)分析　圖2　Mbf1同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析　圖3　套疊PCR法合成目的基因的同源重組突變框片段。3’端同源序列（3?FR，926 bp），5’端同源序列（5?FR，929 bp），報(bào)告基因片段（NEO，2 098 bp），基因同源重組敲除框（KO，3 953 bp）　圖4　PCR檢測(cè)基因突變株。以隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株H99基因組DNA為陰性對(duì)照，L1?4由引物M?DP?F／NEO?R擴(kuò)增（2 151 bp），L1?4’（2 840 bp）和H99’由引物M?DP?R／NEO?F．?dāng)U增Fig．1　Bioinformatics analysis of Mbf1 domain structures among different eukaryotic species　Fig．2　Phylogenetic analysis of Mbf1 orthologs among different eukaryotic species　Fig．3　Construction of MBF1 homologous recombination cassette with overlap PCR　Fig．4　Screening of correct mutant strains by diagnostic PCR

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［本文編輯］衛(wèi)鳳蓮

Identification and knocking?out of transcription co?activation factor gene MBF1 in Cryptococcus neoformans

ZHOU Zhao?jing1，2，MENG Yun?fang1，2，ZHAO Jing?yu1，3，SANG Jun?jun1，ZHANG Chao1，F(xiàn)A Zhen?zong1，F(xiàn)ANG Wei2，LIAO Wan?qing1，2
（1．Institute of dermatology and fungal disease，Key Laboratory of the army fungal disease，Shanghai 200003；2．Department of derma?tology，Changzheng Hospital，Shanghai 200003；3．Dermatology Hospital of Shanghai，Shanghai 200003）

ObjectiveTo construct the mutant strain of transcriptional co?activated factor Mbf1 in Cryptococcus neoformans．

MethodsAmplified the homologous recombination cassette containing report gene NEO and flanking DNA fragments of MBF1 via overlap PCR，which was then transformed into Cryptococcus neoformans through gene gun．The positive transformants was screened by diagnostic PCR and then confirmed by DNA sequencing．Results The target gene MBF1 was successfully knocked out in Cryptococcus neoformans．ConclusionConstruction of the mutant strain would lay the foundation for further pathogenetic studies research of tran?scriptional co?activated factor Mbf1 in Cryptococcus neoformans．

Cryptococcus neoformans；Pathogenesis；Gene Knocking?out．

R 379．5

A

1673?3827（2015）10?0080?04

國(guó)家973項(xiàng)目（2013CB531601）；上海市自然科學(xué)基金（12ZR1454400，12JC1411000）；上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室基金（14DZ2272900）

周兆婧，女（漢族），碩士研究生在讀．E?mail：zhouzhao?jing320＠163．com

廖萬清，E?mail：liaowanqing＠sohu．com；方偉，E?mail：wei?fang081782＠163．com

2014?12?18