陳永平等

摘要：改進(jìn)了淡水水體和沉積物中4種硝基呋喃代謝物呋喃唑酮代謝物（AOZ）、呋喃它酮代謝物（AMOZ）、呋喃妥因代謝物（AHD）、呋喃西林代謝物（SEM）的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測方法。方法采用內(nèi)標(biāo)法定量，提高了定量的準(zhǔn)確性。水及沉積物樣品直接進(jìn)行衍生化后乙酸乙酯提取，化合物采用Thermo C18（5.0 μm，100 mm×2.1 mm）色譜柱進(jìn)行分離，以0.1%甲酸/甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相梯度洗脫。方法的線性范圍為0.1～200 ng/mL，r2≥0.999?？瞻姿w在0.02、1.0、10.0 ng/L 3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為75.4%～82.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.2%～8.7%，檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）分別為0.01 ng/mL和0.02 ng/mL。沉積物樣品在0.3、1.0、10 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平下，平均回收率為77.9%～93.6%，RSD為2.5%～7.8%，檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）分別為0.1 μg/kg和0.3 μg /kg。該方法靈敏度高、選擇性好，適用于實(shí)際淡水養(yǎng)殖環(huán)境水體和底泥中4 種硝基呋喃代謝物呋喃唑酮代謝物的殘留測定。

關(guān)鍵詞：LC-MS/MS；淡水；沉積物；硝基呋喃代謝物

硝基呋喃是人工合成的廣譜抗生素，因其對革蘭氏細(xì)菌體內(nèi)的氧化還原系統(tǒng)進(jìn)行干擾被廣泛用于預(yù)防和治療此類細(xì)菌引起的腸胃道疾病[1-2]，原藥經(jīng)機(jī)體代謝產(chǎn)生的代謝物一部分與生物機(jī)體細(xì)胞膜蛋白結(jié)合成結(jié)合態(tài)，穩(wěn)定存在于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，另一部分被排泄到體外，直接散布到養(yǎng)殖水體中，或沉積到池塘底部，隨著時(shí)間的推移，被代謝物污染的水體或被排放到其他養(yǎng)殖區(qū)域，造成水體的二次污染，沉積到池塘底部的藥物可能永久殘存，只能靠單純的自然降解來消除[3-7]。研究發(fā)現(xiàn)硝基呋喃類藥物及其代謝物具有強(qiáng)的致癌致畸致突變等毒副作用，國內(nèi)加大了對其代謝物的監(jiān)控力度，但監(jiān)控范圍主要針對當(dāng)前上市或產(chǎn)地水產(chǎn)品，還沒有涉及到養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測。原因一方面養(yǎng)殖環(huán)境水體及沉積物中硝基呋喃類代謝物檢測技術(shù)不夠成熟，另一方面環(huán)境中的藥物與生物體內(nèi)的藥物殘留相關(guān)性了解不夠清楚。監(jiān)控不利導(dǎo)致環(huán)境中的藥物再次被生物體吸收、富集殘存在體內(nèi)，因此從擴(kuò)大監(jiān)控范圍，從根源消除代謝物殘留十分必要。目前文獻(xiàn)主要報(bào)道了水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物檢測技術(shù)[8]，淡水及沉積物中的硝基呋喃類代謝物的測定未見報(bào)道。

本文研究采用對于淡水養(yǎng)殖水體及沉積物直接衍生提取，過微濾膜，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對其進(jìn)行測定，具有高效、靈敏、穩(wěn)定的特性，可作為養(yǎng)殖環(huán)境的監(jiān)控手段。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

AB 4000 Qtrap三重四極桿質(zhì)譜（AB Sciex），電子天平（MettLer ToLedo 公司）；高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；高速組織勻漿機(jī)（飛利浦公司 轉(zhuǎn)速10 000 r/min），MS1 Mini-shaker 渦輪振蕩器（IKA 公司）；MiLLi-Q純水器（MiLLipore 公司）；氮吹儀（Organomation Associates 公司）；移液器（10、20、100、200、1000 μL，Eppendorf 公司）。

AHD、SEM、AMOZ、AOZ 標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；AHD-13C3、SEM-15N13C、AMOZ-D5、AOZ-D4（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；二甲基苯甲醛（色譜純，天津四友科技有限公司）；甲醇（質(zhì)譜純，Thermo 公司）；正己烷（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙酸銨（色譜純，天津四友科技有限公司）；甲酸（色譜純，科密歐公司）；濃鹽酸（優(yōu)級純，天津四友有限公司）；磷酸氫二鉀（ 分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。

1.2溶液配制

1.2.10.002 moL/L醋酸銨溶液稱取0.15 g醋酸銨，用水溶解并定容至1 000 mL。

1.2.2甲醇溶液甲醇∶水=5∶95（V/V）。

1.2.30.2 moL/L鹽酸溶液量取濃鹽酸（ρ=1.19 g/mL）18.0 mL，用水稀釋至1 000 mL。

1.2.40.05 moL/L 2-硝基苯甲醛溶液稱取0.037 8 g 2-硝基苯甲醛，溶于5 mL二甲亞砜中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.5磷酸氫二鉀溶液1.0 moL/L。稱取87.1 g磷酸氫二鉀，溶解于500 mL水中。

1.2.6同位素內(nèi)標(biāo)儲備液AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM·HCl-13C -15N2，濃度均為100 μg/mL。分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM·HCl-13C-15N2內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，配成濃度為1.0 mg/mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20℃冷凍保存。

1.2.7AOZ標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.0 mg/mL。準(zhǔn)確稱取10.0 mg AOZ，用甲醇溶解避光定容至10 mL棕色容量瓶中，-20℃冷凍保存。

1.2.8AMOZ標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.0 mg/mL。準(zhǔn)確稱取10.0 mg AMOZ，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，-20 ℃冷凍保存。

1.2.9SEM標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.0 mg/mL。準(zhǔn)確稱取14.9 mg SEM·HCl，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，-20 ℃冷凍保存。

1.2.10AHD標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.0 mg/mL。準(zhǔn)確稱取13.2 mg AHD·HCl，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，-20 ℃冷凍保存。

1.3樣品前處理

1.3.1養(yǎng)殖淡水水樣取水樣10 mL于50 mL塑料離心管中，加入硝基呋喃代謝物內(nèi)標(biāo)50μL（100 ng/mL），加入6.0 mL鹽酸溶液，再加入200 μL衍生試劑，漩渦2 min，置于恒溫水浴振蕩器上35 ℃避光振蕩約16 h，取出離心管冷卻至室溫后，加入5.0 mL磷酸氫二鉀溶液，加入10 mL乙酸乙酯，漩渦2 min，以10 000 r/min離心3 min，于40 ℃氮?dú)獯抵两桑瑲堅(jiān)?.0 mL流動(dòng)相溶解，過0.2 μm濾膜，待上機(jī)。

1.3.2沉積物樣品取風(fēng)干后的沉積物樣品5.0 g于50 mL塑料離心管中，加入硝基呋喃代謝物內(nèi)標(biāo)50 μL（100 ng/mL），再加入200 μL的衍生試劑，加入5.0 mL鹽酸溶液，漩渦2 min，然后置于恒溫水浴振蕩器上35 ℃避光振蕩約16 h，取出離心管冷卻至室溫后，加入5.0 mL磷酸氫二鉀溶液，加入10.0 mL乙酸乙酯，漩渦2 min，以10 000 r/min離心5 min，于40 ℃氮?dú)獯抵两桑瑲堅(jiān)?.0 mL流動(dòng)相溶解，過0.2 μm濾膜，待上機(jī)。

1.4儀器分析條件

1.4.1色譜條件

2結(jié)果與討論

2.1色譜質(zhì)譜條件的選擇

流動(dòng)相無機(jī)相選擇水相中加入一定量乙酸銨（5 mmoL·L-1），再加入一定量甲酸（0.1%），增強(qiáng)各化合物離子化效果，目的是為了增加各組分的保留時(shí)間，改善各組分的峰形。流動(dòng)相有機(jī)相選擇甲醇和乙腈作對比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明甲醇和水相配合做流動(dòng)相時(shí)，化合物分離效果較好。

取衍生好的四種硝基呋喃代謝物100 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蠕動(dòng)泵將四種代謝物的衍生溶液注入離子源，在ESI（+）離子化模式下，分別對噴霧電壓、離子源溫度、GAS1、GAS2、碰撞能量等條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化參數(shù)見表1。

2.2色譜柱的選擇

分別選擇Thermo C18柱（5μm， 100×2.1 mm i.d.），島津 C8柱（2.1 μm， 100×2.1 mm i.d.），Agilent C18柱（5μm， 100×4.6 mm i.d.）以乙酸銨溶液、甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，Thermo C18柱出峰分離效果均好于島津 C8柱、Agilent C18柱，最終實(shí)驗(yàn)選擇Thermo C18柱（5μm， 100×2.1 mm i.d.）作為四種代謝物分離色譜柱。

2.3衍生化時(shí)間的選擇

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在沉積物中添加同一濃度（1.0 μg/Kg）的四種硝基呋喃代謝物，加入2-硝基苯甲醛（0.05 moL/L）150、200μL，參考相關(guān)文獻(xiàn)溫度設(shè)定為35、37 ℃，衍生化時(shí)間設(shè)定為2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、18 h、20 h，結(jié)果表明衍生化試劑為200 μL、35 ℃條件下衍生16 h時(shí)衍生化最充分、衍生物最穩(wěn)定。

2.4方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度

通過優(yōu)化，用內(nèi)標(biāo)法定量四種呋喃類代謝物的線性范圍，結(jié)果顯示兩者質(zhì)量濃度均在0.2～200 ng/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r2 大于0.999?；厥章示笥?0%，按S/N>3計(jì)算得該方法在環(huán)境水樣和底泥樣品中的檢出限（ LOD） 分別為0.01 ng /mL 和0.1μg /kg，以信噪比S/N>10得其定量下限（LOQ）分別為0.02 ng /mL和0.3 μg /kg。

2.5方法的回收率與精密度

在空白環(huán)境水樣中四類呋喃類代謝分別添加0.02、1.0、10.0 ng/L 3個(gè)濃度梯度，沉積物中四類呋喃類代謝分別添加0.3、1.0、10.0 μg/kg 3個(gè)濃度梯度，同時(shí)每個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)重做五次，按照本方法處理后測定，回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。沉積物中AOZ的平均回收率為77.9%～88.4%，RSD 為2.5%～7.2%，AMOZ的平均回收率為86.6%～90.8%，RSD 為1.9%～7.8%，SEM的平均回收率為90.4%～92.5%，RSD 為3.5%～6.2%，AHD的平均回收率為87.3%～93.6%，RSD 為1.4%～4.6%；水體AOZ的平均回收率為77.9%～88.4%，RSD 為3.2%～6.1%，AMOZ的平均回收率為76.2%～78.6%，RSD 為3.3%～7.3%，SEM的平均回收率為78.8%～81.3%，RSD 為2.9%～8.4%，AHD的平均回收率為76.8%～82.7%，RSD 為5.7%～8.7%。因此，本方法具有較高的準(zhǔn)確性、靈敏性、穩(wěn)定性。

3結(jié)論

本文通過優(yōu)化淡水及沉積物中四種硝基呋喃類代謝物提取凈化、色譜質(zhì)譜條件，改進(jìn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境淡水水體和沉積物中呋喃類代謝物殘留測定方法。結(jié)果表明，本方法在0.2～200 ng/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，水體和沉積物中的定量限分別為0.02 ng/mL和0.3 μg/kg。可作為淡水水體和沉積物中呋喃類代謝物殘留的檢測方法，成果應(yīng)用可為養(yǎng)殖環(huán)境中代謝物監(jiān)控，生物體與養(yǎng)殖環(huán)境之間相關(guān)性分析及環(huán)境安全評價(jià)提供分析手段，也為水產(chǎn)品中藥物溯源提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] GREGORY O N， TIMOTHY H B， GREGORY W D. Semicarbazide formation in flour and bread[J]. J Agric Food Chem， 2008， 56（6）：2064-2067

[2] 孫言春，張潔，牟振波，等. 固相萃取液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留研究[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2011，1（2）：54-59

[3] Wang Chuanxian，Huang Fan，Wang Min，et al. Determination of metabolite residues of nitrofuran antibiotics in aquatic products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. ChineseJournal of Chromatography，2013，31（3）： 206–210

[4] Xu Zhenlin，Shen Yudong，Sun Yuanming，et al. Novel hapten synthesis for antibody production and development of an enzymelinked immunosorbent assay for determination of furaltadone metabolite 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone （AMOZ）[J]. Talanta，2013，103： 306–310

[5] 丁濤，徐錦忠，沈崇鈺，等. 高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測定蜂王漿中的四種硝基呋喃類藥物的代謝物[J]. 色譜，2006，24（5）：432–435

[6] Ca ada-Ca ada F，Mu oz de la Pe a A，Espinosa-Mansilla A.Analysis of antibiotics in fi sh samples [J]. Anal Bioanal Chem，2009，395（4）： 987–1 008

[7] Víctor Hormazábal，Tone Norman Asp. Determination of the Metabolites of Nitrofuran Antibiotics in Meat by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry[J]. Journal of Liquid

Chromatography & Related Technologies，2005，27：2759–2765

[8] 徐英江，宮向紅，田秀慧.UPLC MS/MS測定海水及沉積物中硝基呋喃類代謝物.環(huán)境化學(xué)， 2009， 28（4）：606-607