唐勇琛，梁學(xué)政，呂建偉，謝勝，甄漢深，丘琴，曾坤

(1.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院藥學(xué)部，柳州 545001;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001)

溫胃陽(yáng)膠囊是廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院在臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上研制的純中藥制劑，目前擬作為該院制劑進(jìn)行研究申報(bào)。該方由桂枝、炮姜、砂仁、益智仁、白豆蔻、法半夏、生姜、茯苓、紅參組成，方中桂枝溫陽(yáng)、消痞、行滯為君;炮姜溫中通絡(luò)，散寒除脹，降逆和胃為臣;砂仁、白豆蔻行氣、溫中、化濕，益智仁溫脾暖腎，以溫補(bǔ)中陽(yáng)之氣，使行氣、祛寒濕而不傷正，共為佐使，臨床用于治療中陽(yáng)虧虛特別是胃陽(yáng)不足所致的功能性消化不良。桂枝的主要有效成分為桂皮醛，為揮發(fā)油性成分，且方中的炮姜、砂仁、益智仁、白豆蔻均為姜科植物，含有豐富的揮發(fā)油，而其所含揮發(fā)油均為有效成分，由于這類(lèi)成分具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，在提取及制備過(guò)程中易損失，為保證藥效，需將此類(lèi)成分單獨(dú)提取處理后入藥。因此，筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，并以 β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行包合，以最大程度保留有效成分，從而保證該復(fù)方制劑的臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 揮發(fā)油提取器(上海醫(yī)用分析儀器廠，型號(hào):HAD-1 000 mL);101A-3E電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);BP211D電子天平(德國(guó)賽多利斯，感量:0.01 mg);98-Ⅱ-B電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);FW100高效萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);GC2105格力電磁爐(格力電器中山市小家電制造有限公司)。

1.2 試藥 桂枝、炮姜、砂仁、益智仁、白豆蔻均購(gòu)于南寧生源中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)寧小清高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2010版中藥飲片的規(guī)定，均為正品;β-CD(郁南縣永光環(huán)狀糊精有限公司，批號(hào):20120502);無(wú)水硫酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):F200060515，含量≥99%);其他試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取工藝

2.1.1 揮發(fā)油提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道[1-2]，以揮發(fā)油得率為考察指標(biāo)，對(duì)藥材揮發(fā)油得率影響較大的加水量、藥材粒徑及提取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行考察。每個(gè)因素選取3個(gè)水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)方案，按L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，平行操作，因素水平見(jiàn)表1。

表1 揮發(fā)油提取工藝因素及水平Tab.1 Factors and levels of extraction technology for volatile oil

2.1.2 方法及數(shù)據(jù)處理 按處方比例分別稱(chēng)取桂枝、炮姜、白豆蔻、砂仁及益智仁共85 g，按正交實(shí)驗(yàn)表下設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行揮發(fā)油提取。按《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版(一部)附錄ⅩD揮發(fā)油測(cè)定法提取揮發(fā)油，冷卻后讀取其體積。揮發(fā)油得率(%)=(揮發(fā)油體積/生藥材質(zhì)量)×100%(mL·g－1)。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及直觀分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 揮發(fā)油提取工藝條件L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of L9(34)orthogonal experiment on extraction technology for volatile oil

表3 揮發(fā)油提取工藝方差分析表Tab.3 Variance analysis on extraction technology for volatile oil

2.1.3 結(jié)果分析 由正交實(shí)驗(yàn)直觀分析(表2)結(jié)果可知，最佳組合為A2B2C3。根據(jù)極差值大小，對(duì)揮發(fā)油提取影響大小順序依次為:C(提取時(shí)間)＞B(藥材粒徑)＞A(加水倍數(shù))。而方差分析結(jié)果(表3)表明:因素B、C，即藥材粒徑與提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取有顯著影響，B因素K2最大，故選2水平，C因素K3最大，故選3水平，因素A差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即加水倍數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，同時(shí)出于節(jié)能考慮，加水量可選擇較低水平，因此最后確定最佳工藝為A1B2C3，即:藥材粉碎(過(guò)10目篩)，加6倍水量，提取5 h。

2.1.4 揮發(fā)油提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按最佳工藝條件A1B2C3，即:藥材粉碎(過(guò)10目篩)、加6倍水量、提取5 h，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，投料3批進(jìn)行工藝驗(yàn)證，結(jié)果揮發(fā)油得率均較高，平均為1.72%，RSD=4.03%。表明該工藝穩(wěn)定可行，可較好地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 揮發(fā)油提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Tab.4 Verification results of extraction technology for volatile oil

2.2 揮發(fā)油的包合工藝

2.2.1 揮發(fā)油包合工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，以對(duì)揮發(fā)油包合物影響較明顯的3個(gè)因素:β-CD與油的投料配比、加水量、研磨時(shí)間為主要考察因素，采用正交設(shè)計(jì)，各取3個(gè)水平，并以包合物收率和揮發(fā)油包合率的綜合評(píng)分(權(quán)重系數(shù)分別為0.3，0.7)為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。因素及水平見(jiàn)表 5[3-6]。

2.2.2 揮發(fā)油包合物的制備及測(cè)定 精密稱(chēng)取β-CD24.0 g，精密稱(chēng)定質(zhì)量，加適量水研磨均勻，邊研磨邊滴加一定量以2倍量乙醇稀釋的揮發(fā)油，共同研磨1 h，抽濾，加無(wú)水乙醇洗滌沉淀3次，每次5 mL，于40℃真空干燥24 h，即得揮發(fā)油β-CD包合物，放置待測(cè)。稱(chēng)取包合物10.0 g，精密稱(chēng)定，加入2倍量乙酸乙酯洗滌，晾干，加水100 mL，按《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版(一部)附錄ⅩD揮發(fā)油測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。其中，包合物收率(%)=包合物質(zhì)量(g)/[揮發(fā)油質(zhì)量(g)+β-CD質(zhì)量(g)]×100%;揮發(fā)油包合率(%)=包合后提取的揮發(fā)油質(zhì)量(g)/加入揮發(fā)油的總質(zhì)量(g)×100%[3，5，7-8]。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及直觀分析見(jiàn)表6，方差分析見(jiàn)表7。

表5 揮發(fā)油包合工藝因素及水平Tab.5 Factors and levels of inclusion technology for volatile oil

2.2.3 結(jié)果分析 由表6直觀分析可知，最佳組合為A3B1C3。根據(jù)極差值大小，對(duì)揮發(fā)油包合影響大小順序依次為:A＞B＞C。而表7方差分析結(jié)果表明:β-CD與油的投料配比對(duì)包合物的綜合影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A因素K3最大，故選3水平，因素B、C差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即加水量和研磨時(shí)間對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，同時(shí)出于節(jié)能考慮，加水量和研磨時(shí)間可選擇較低水平，因此最后確定最佳工藝為 A3B1C1，即:β-CD與油的投料配比為8∶1、加水量為1倍、研磨時(shí)間為30 min。

2.2.4 揮發(fā)油包合工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按上述最佳工藝條件A3B1C1，即β-CD與油的投料配比為8∶1、加水量為1倍、研磨時(shí)間為30 min。投料3批進(jìn)行工藝驗(yàn)證，結(jié)果包合物收率和揮發(fā)油包合率均較高，表明該工藝穩(wěn)定可行，可較好地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，結(jié)果見(jiàn)表8。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以A3B1C1，即β-CD與油的投料配比為8∶1、加水量為1倍、研磨時(shí)間為30 min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，平均包合物收率為93.01%，RSD為0.27%;平均揮發(fā)油包合率為74.82%，RSD為0.04%，結(jié)果均較理想。工藝條件合理、穩(wěn)定、可行。

2.3 揮發(fā)油包合物的TLC鑒別 稱(chēng)取揮發(fā)油β-CD包合物0.2 g，以無(wú)水乙醇5 mL超聲溶解15 min，離心后取上清液，即得包合物樣品溶液①;精密移取包合前揮發(fā)油0.1 mL，以無(wú)水乙醇5 mL稀釋溶解即得包合前揮發(fā)油樣品溶液②;取適量包合物以水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，精密移取所回收揮發(fā)油0.1 mL，以無(wú)水乙醇5 mL稀釋溶解，即得包合后揮發(fā)油樣品溶液③;β-CD 0.2 g，加入揮發(fā)油 0.1 mL，使其充分混勻，再以無(wú)水乙醇5 mL超聲溶解15 min，離心后取上清液，即得混合物樣品溶液④。分別吸取適量上述4份樣品溶液點(diǎn)樣于同一硅膠板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯(85∶15)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果揮發(fā)油、包合物中回收的揮發(fā)油以及揮發(fā)油與β-CD混合物在硅膠板上顯相同的斑點(diǎn)(斑點(diǎn)的Rf值和顏色一致)，而包合物提取液則無(wú)相應(yīng)的斑點(diǎn)。表明揮發(fā)油已包合于β-CD內(nèi)部，形成了穩(wěn)定的與混合物物相不同的包合物，包合物表面基本無(wú)揮發(fā)油附著，且包合前后揮發(fā)油成分未發(fā)生變化，包合過(guò)程對(duì)揮發(fā)油化學(xué)成分無(wú)影響。見(jiàn)圖1。

表6 揮發(fā)油包合工藝條件L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Results of L9(34)orthogonal experiment on inclusion technology for volatile oil

表7 揮發(fā)油包合工藝方差分析表Tab.7 Variance analysis on inclusion technology for volatile oil

表8 揮發(fā)油包合工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Tab.8 Verification results on inclusion technology for volatile oil

3 討論

筆者在本研究中通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確立溫胃陽(yáng)膠囊揮發(fā)油提取及包合工藝中的參數(shù)，確定揮發(fā)油的最佳提取及包合工藝條件，并進(jìn)行工藝驗(yàn)證，證明該工藝合理、穩(wěn)定、可行，可為工業(yè)化生產(chǎn)條件的制定提供理論依據(jù)。在揮發(fā)油提取工藝研究的過(guò)程中，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在藥材粒徑、加水量、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間4個(gè)因素中，只有藥材粒徑、加水量、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)揮發(fā)油的提取量有較明顯的影響，故考慮采用藥材粒徑、加水量、提取時(shí)間作為提取揮發(fā)油正交實(shí)驗(yàn)的因素，最后綜合正交實(shí)驗(yàn)的方差分析和直觀分析結(jié)果優(yōu)選各因素水平。包合工藝中，β-CD包合揮發(fā)油常見(jiàn)的方法有飽和水溶液法和研磨法，其中研磨法因不受β-CD水中溶解度的限制，且具有包合率高、所得包合物粉末性狀細(xì)膩、便于混合等特點(diǎn)，因而適合于工業(yè)大生產(chǎn)。

中藥揮發(fā)油是存在于植物體內(nèi)的一類(lèi)可隨水蒸氣蒸餾而得到的油狀液體，主要成分為萜類(lèi)衍生物、脂肪族化合物等。它對(duì)光、空氣、溫度的影響較敏感，受其影響易分解變質(zhì)，若是在膠囊劑中直接加入揮發(fā)油，揮發(fā)油易損失且氧化變質(zhì)，經(jīng)β-CD包合后，穩(wěn)定性可顯著提高，同時(shí)也遮掩了不良?xì)馕禰9]。另外，該處方量藥材提取所得揮發(fā)油的量相當(dāng)大，如果直接加入到干浸膏粉中，在60℃條件下烘干，揮發(fā)油損失量較大，而且揮發(fā)油在該制劑中為重要的有效成分，故不能直接加入處理。在β-CD包合物的制備過(guò)程中，客體的投入量大小對(duì)包合效果影響較大，在一定范圍內(nèi)可以提高包合率，但是過(guò)低或過(guò)多均會(huì)降低包合率。筆者在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)客體投入量對(duì)包合效果的影響進(jìn)行探討，結(jié)果表明，β-CD與油的投料配比為8∶1、加水量為1倍時(shí)包合效果好;在低溫40℃研磨30 min，包合物收率、揮發(fā)油包合率均較高。

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