周白玉，張兵，陳海明，王興林，劉祖明，李方明，劉金偉，楊紹華

黔西南漢族人群表皮生長(zhǎng)因子前體蛋白編碼序列第14和16外顯子中單核苷酸多態(tài)性研究

周白玉，張兵，陳海明，王興林，劉祖明，李方明，劉金偉，楊紹華

背景與目的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)在蛋白編碼序列中多以富集成簇的方式分布，并提示其可能有民族區(qū)域和人種之間的差異性，然而SNPs在黔西南漢族人群表皮生長(zhǎng)因子前體蛋白(preproEGF)編碼序列第14和16外顯子中的分布狀況迄今尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究擬對(duì)35例黔西南漢族受試者進(jìn)行研究，旨在分析SNPs在preproEGF編碼序列第14和16外顯子中的分布特征。方法設(shè)計(jì)合成4條引物，分別對(duì)35例漢族受試者preproEGF編碼序列第14和16外顯子區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物的DNA測(cè)序;檢索單核苷酸多態(tài)性資料庫(kù)(dbSNP)獲取資料并與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果35例黔西南漢族受試者中13例(37.1%)在preproEGF編碼序列的2 525 bp位點(diǎn)出現(xiàn)SNPs，基因型為AG和GG，頻率分別為69.2%和30.8%，其等位基因頻率分別為A 34.6%和G 65.4%;27例(77.1%)在2 576 bp位點(diǎn)有SNPs，基因型為AA和AG，頻率分別為66.7%和33.3%，等位基因頻率分別為A 83.3%和G 16.7%。相比之下，北京漢族受試者較黔西南漢族受試者在preproEGF編碼序列第14外顯子內(nèi)多了1個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，即2 619 bp位點(diǎn);歐美等其他民族不僅在preproEGF編碼序列第14外顯子內(nèi)分布有rs199935855等7個(gè)SNPs，而且在其第16外顯子內(nèi)也分布有rs149396988等6個(gè)SNPs;黔西南漢族和北京漢族受試者在preproEGF編碼序列的第16外顯子內(nèi)均未見(jiàn)有SNPs分布。結(jié)論在黔西南漢族、北京漢族和歐美等民族的preproEGF編碼序列第14和16外顯子中，SNPs分別具有各民族、各種族的特征性分布，據(jù)此可區(qū)分不同地域的種族和人群，甚至進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。也可將這些呈特征性分布的SNPs視為遺傳標(biāo)記進(jìn)而深入研究SNPs與疾病發(fā)生的關(guān)系。

漢族;貴州;多態(tài)性，單核苷酸;表皮生長(zhǎng)因子前體蛋白;多位點(diǎn)測(cè)序分型

周白玉，張兵，陳海明，等．黔西南漢族人群表皮生長(zhǎng)因子前體蛋白編碼序列第14和16外顯子中單核苷酸多態(tài)性研究［J］．中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(29):3587－3591．［www.chinagp.net］

Zhou BY，Zhang B，Chen HM，et al．Single nucleotide polymorphisms in exon 14 and 16 in the coding sequence of prepro－epidermal growth factor in Han people of Qianxi'nan Prefecture［J］．Chinese General Practice，2015，18(29): 3587－3591．

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)廣泛分布于全球各色人種的染色體及其基因序列中［1］。表皮生長(zhǎng)因子前體蛋白(prepro－epidermal growth factor，preproEGF)基因具有SNPs分布的代表性或典型性［2］。

preproEGF基因位于染色體4q25，序列全長(zhǎng)約110 kb，含有24個(gè)外顯子;其表達(dá)轉(zhuǎn)錄的mRNA序列長(zhǎng)約5 kb，編碼一條含1 207個(gè)氨基酸的蛋白多肽鏈，即preproEGF，其中的表皮生長(zhǎng)因子(53個(gè)氨基酸)對(duì)人體表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和代謝發(fā)揮十分重要的作用;此外，該蛋白還含有數(shù)段重復(fù)的低密度脂蛋白受體和類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域并且兼具潛在的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，這表明preproEGF蛋白除了具有表皮生長(zhǎng)因子的功能外，還兼具低密度脂蛋白受體組成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和參與出凝血機(jī)制的生物學(xué)功能，對(duì)機(jī)體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝和生理功能發(fā)揮多方面的重要作用［3］。另一方面，有研究顯示preproEGF基因的遺傳變體或多態(tài)，特別是其SNPs可能與冠心病、智力發(fā)育障礙和腫瘤發(fā)生等臨床疾病具有相關(guān)性。研究表明preproEGF基因序列第61 bp位點(diǎn)的SNPs(A/G)與歐美人群發(fā)生黑色素瘤密切相關(guān)［4］。由此可見(jiàn)，探索鑒定SNPs在preproEGF基因和編碼序列中的分布情況不僅對(duì)于人類(lèi)分子遺傳學(xué)，而且對(duì)醫(yī)學(xué)研究皆具重大意義。

在對(duì)SNPs探究早期，有研究認(rèn)為從概率上講SNPs以平均1/1 000個(gè)單核苷酸的概率分布于DNA序列中，但之后有研究顯示SNPs也會(huì)以富集成簇的方式間隔分布［5］。隨著研究的不斷深入和擴(kuò)展，迄今已發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的SNPs分布在人類(lèi)基因組序列中。與此同時(shí)，美國(guó)生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的單核苷酸多態(tài)性資料庫(kù)(single nucleotide polymorphism database，dbSNP)匯總并向全球公開(kāi)了這些SNPs［1］。目前已有研究憑借NCBI平臺(tái)對(duì)dbSNP的SNPs進(jìn)行檢索，表明相關(guān)SNPs多以密集叢簇的方式間隔分布于編碼preproEGF的mRNA/cDNA序列中，其中尤以SNPs較多地集中分布在以外顯子11～12和16～19區(qū)段為間隔的第13～15外顯子區(qū)段頗具典型特征［1，6］。dbSNP相關(guān)SNPs在我國(guó)除北京地區(qū)以外的漢民族群體preproEGF編碼序列中的分布情況尚不清楚［1］。為彌補(bǔ)此項(xiàng)不足，本研究擬對(duì)貴州省黔西南州漢族人群preproEGF編碼或mRNA/cDNA序列中具有SNPs分布特征的上述典型區(qū)段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究和資料分析，以探明SNPs的分布特征及其與不同國(guó)家、地區(qū)、民族和種群之間是否存在差異性，為進(jìn)一步的群體遺傳學(xué)和分子醫(yī)學(xué)的診療應(yīng)用提供基礎(chǔ)的和有價(jià)值的參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象2009－05－22至2010－04－29選取35例彼此互無(wú)血緣關(guān)系且其父母雙親均是漢族的健康個(gè)體，來(lái)源于貴州省黔西南州人民醫(yī)院體檢中心。年齡18～59歲，平均年齡(35.3±14.7)歲;男19例，女16例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器DNA提取試劑盒(美國(guó)QiaGen公司)，PCR擴(kuò)增試劑盒(日本TaKaRa公司)，50×TAE;電泳緩沖液(上海生物工程公司)。核酸測(cè)定儀(德國(guó)Eppendorf公司)，PCR－2400擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)，Mastercycler梯度PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)，平板電泳儀(美國(guó)Bio－Rad公司)，凝膠成像儀(美國(guó)SYNGENE公司)。PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序引物的合成(上海賽百盛公司)。

1.2.2 DNA樣本的制備和引物設(shè)計(jì)按照DNA提取試劑盒操作程序從受試者外周血樣本提取DNA。

對(duì)比參照NCBIBlast程序選出的引物序列，分別在preproEGF基因的第14和16外顯子所屬區(qū)段內(nèi)設(shè)計(jì)了4條用于PCR和DNA測(cè)序的引物(見(jiàn)表1)。

1.2.3 目標(biāo)區(qū)段的PCR擴(kuò)增配制PCR反應(yīng)液:10× PCR Buffer 5.0μl，dNTPMixture(各2.5 mmol/L)4.0 μl，受試者DNA模板8.0μl，正、反向引物各0.5μl，滅菌純水31.5μl，充分混勻后再加入濃度為5.0 U/μl的TaKaRa Taq酶0.5μl至反應(yīng)總體積為50.0μl，輕輕混勻后置于PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增。其有效擴(kuò)增條件為:先94℃3 min預(yù)變性，后于94℃30 s變性，63.8℃35 s引物復(fù)性和72℃1 min 30 s延伸，進(jìn)行29個(gè)循環(huán)，然后72℃7 min后降溫至4℃保持恒溫。

表1 4條測(cè)序引物序列表Table 1 Sequence of4 primers

1.2.4 PCR產(chǎn)物的DNA測(cè)序及其序列分析PCR擴(kuò)增的目標(biāo)DNA片段送上海英駿生物技術(shù)有限公司和寶生物(大連)工程有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。應(yīng)用ABI3130、ABI3700和ABI3730等DNA測(cè)序儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。同時(shí)根據(jù)研究的需要，對(duì)PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行必要的雙向和重復(fù)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果以NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算漢族SNPs的等位基因和基因型頻率。通過(guò)檢索dbSNP，對(duì)比黔西南、北京漢族群體和其他種族之間的異同，列表并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分別檢測(cè)受試者DNA的PCR產(chǎn)物，于紫外光燈下可見(jiàn)兩條分別長(zhǎng)約0.64 kb和0.59 kb的DNA擴(kuò)增帶(見(jiàn)圖1)，其中1～7泳道為第14外顯子區(qū)段，8～11泳道為第16外顯子區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1 黔西南漢族受試者DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Figure 1 PCR amplification products of DNA in Han subjects of Qianxinan Prefecture

2.2 DNA序列測(cè)定和dbSNP資料對(duì)比分析

2.2.1 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定測(cè)序圖譜顯示受試者編碼preproEGF的第14外顯子序列內(nèi)有兩個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)了單核苷酸替換改變，即2 525 bp(G/A)和2 576 bp(A/G)，且在這兩個(gè)位點(diǎn)還呈現(xiàn)有SNPs雜合套峰的現(xiàn)象(見(jiàn)圖2)。

圖2 黔西南漢族受試者DNA測(cè)序圖譜和dbSNP對(duì)照?qǐng)D譜Figure 2 Sequencing chromatogram of DNA in Han subjects of Qianxinan prefecture and the dbSNP tonrol

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，有13例受試者在2 525 bp位點(diǎn)有SNPs，占37.1%，其基因型有AG和GG兩種;有27例受試者在2 576 bp有SNPs，占77.1%，其基因型也有兩種，即AA和AG(見(jiàn)表2)。

表2 黔西南漢族受試者preproEGF編碼序列第14外顯子兩個(gè)位點(diǎn)的SNPs〔n(%)〕Table2 SNPs of two sites in exon 14 in the coding sequence of preproEGF in Han subjects of Qianxinan

2.2.2 與北京漢族受試者SNPs分布情況相比結(jié)果顯示35例黔西南漢族受試者在2 525 bp和2 576 bp兩個(gè)位點(diǎn)的SNPs基因頻率與43例北京漢族受試者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)表3、4)。

表3 不同地區(qū)漢族受試者preproEGF編碼序列第14外顯子2 525 bp位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 3 Comparison of genotype and alleles frequency of 2 525 bp site in exon 14 in the coding sequence of preproEGF among Han subjects of different regions

表4 不同地區(qū)漢族受試者preproEGF編碼序列第14外顯子2 576 bp位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 4 Comparison of genotype and alleles frequency of 2 576 bp site in exon 14 in the coding sequence of preproEGF among Han subjects of different regions

2.2.3 計(jì)算黔西南漢族受試者的基因頻率并與dbSNP的資料比較本研究在第14外顯子序列內(nèi)未檢測(cè)到2 619 bp位點(diǎn)有SNP發(fā)生;與其他地區(qū)種族(例如美歐人群)的SNPs分布情況相比，本研究在第16外顯子序列內(nèi)未檢測(cè)到任何單核苷酸改變即SNPs發(fā)生(見(jiàn)表5)。

表5 在不同地區(qū)民族和種族preproEGF編碼序列中SNPsTable 5 Comparison of SNPs in the coding sequence of preproEGF among people of different nationality regions and races

3 討論

3.1 鑒于SNPs與黑色素瘤等疾病相關(guān)，因而探究其在preproEGF基因序列中的分布狀況已引起廣泛關(guān)注［2，7］。現(xiàn)已有研究表明，SNPs在preproEGF基因組序列中多以平均1/1 000個(gè)單核苷酸概率或密度分布，在內(nèi)含子中的分布亦是如此;而在編碼preproEGF的24個(gè)外顯子中則多以富集叢簇間隔分布為特征，這在第14和16外顯子最為典型［1－2，6］。然而，SNPs在本地區(qū)漢民族preproEGF編碼序列中的分布是否也具同樣的特征尚不清楚。為此，本研究采用PCR、DNA測(cè)序并數(shù)量分析等技術(shù)從定性與定量?jī)蓚€(gè)方面探究了SNPs在35例黔西南漢族受試者preproEGF編碼序列第14和16外顯子中的分布狀況。在定性方面，首先可觀察到有兩個(gè)SNPs (rs2302135和rs2237051，2 525 bp和2 576 bp位點(diǎn))彼此間僅相隔51 bp而分布于第14外顯子中，提示這是一個(gè)SNPs富集分布的熱點(diǎn)外顯子;與之相反，在序列長(zhǎng)度為122 bp的第16外顯子中未見(jiàn)到有任何SNPs，提示該外顯子可能系保守序列，可視為SNPs分布的間隔外顯子。這一結(jié)果與之前有關(guān)SNPs在人preproEGF編碼序列第14外顯子內(nèi)富集成簇而在第16外顯子內(nèi)卻是零分布的報(bào)道［6］基本上可相互印證。其次，在數(shù)量方面，有13例SNPs分布在2 525 bp位點(diǎn)，27例SNPs分布在2 576 bp位點(diǎn)。同時(shí)，這2個(gè)SNPs位點(diǎn)各自獨(dú)具其特征性的基因型和等位基因頻率，具體在2 525 bp位點(diǎn)其基因型是AG和GG，頻率分別為69.2%和30.8%，等位基因頻率分別為A(34.6%)和G(65.4%);而在2 576 bp位點(diǎn)其基因型則為AA和AG，頻率分別為66.7%和33.3%，等位基因頻率分別為A(83.3%)和G(16.7%)。黔西南漢族特有的這些SNPs基因型和等位基因頻率將有助于區(qū)域群體的區(qū)分和鑒定，對(duì)群體遺傳學(xué)的研究顯然具有參考價(jià)值和意義［8］。

3.2 參考dbSNP中SNPs的資料，本研究對(duì)比分析了北京和黔西南的漢族受試者，結(jié)果顯示preproEGF編碼序列第14外顯子中的2個(gè)SNPs即rs2302135和rs2237051在兩個(gè)群體中均可見(jiàn)到;在北京漢族受試者preproEGF編碼序列第14外顯子中還可見(jiàn)到1個(gè)位于2 619 bp的SNPs即rs6413481［1，6，9］。因此，在北京漢族受試者preproEGF編碼序列第14外顯子中有3個(gè)SNPs位點(diǎn)分布，而黔西南漢族受試者中僅只有2個(gè)SNPs位點(diǎn)。這既是北京漢族的SNPs分布特征之一，同時(shí)也是區(qū)別于黔西南漢族的一個(gè)明確的SNPs標(biāo)志，提示雖然同為居住在國(guó)內(nèi)的漢族，卻可能因地處南北區(qū)域的不同而出現(xiàn)其SNPs分布的差異性。另一方面，比較分析北京和黔西南漢族受試者2 525 bp和2 576 bp位點(diǎn)的基因頻率雖未見(jiàn)其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但并不意味著二者的SNPs基因頻率也是如此，尚待進(jìn)一步的研究予以解答。

3.3 作為SNPs富集成簇分布間隔區(qū)段的第16外顯子，在本研究中并未見(jiàn)到任何SNPs分布于其中，這一結(jié)果與有關(guān)研究報(bào)道相一致［6］。然而，通過(guò)檢索dbSNP并觀察其SNPs在全球各民族/種族中的分布，本研究結(jié)果與之相比，分布在preproEGF編碼序列中的SNPs明顯增多，不僅第14外顯子有SNPs分布，而且本來(lái)是零分布的第16外顯子也有SNPs分布其中;計(jì)數(shù)在這兩個(gè)外顯子內(nèi)的SNPs共有13個(gè)，其中7個(gè)分布于包括漢族在內(nèi)的全球多個(gè)民族/種族的preproEGF編碼序列第14外顯子，而余下的6個(gè)則分布在除漢族以外的其他民族/族的preproEGF編碼序列第16外顯子中［1］;進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，除了在漢族preproEGF編碼序列第14外顯子中的3個(gè)SNPs為全球多民族/種族共有分布外，其余10個(gè)SNPs，即rs375886742、rs370234235、rs199935855、rs148000061、rs140133196、rs375314388、rs369597497、rs190681731、rs149396988和rs372992676皆為其他民族/種族所擁有，因此這些SNPs可望作為標(biāo)志性或標(biāo)簽SNPs用來(lái)區(qū)分是漢族抑或是其他種族，SNPs在 preproEGF編碼序列第14和16外顯子中的分布特征表現(xiàn)出了不同民族之間或種族之間具有差異性。

總而言之，本研究表明SNPs在黔西南漢族、北京漢族和歐美等其他民族的preproEGF編碼序列第14和16外顯子的分布存在著不同程度的差異性。

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Single Nucleotide Polymorphisms in Exon 14 and 16 in the Coding Sequence of Prepro－epidermalGrow th Factor in Han People of Qianxi'nan Prefecture

ZHOU Bai－yu，ZHANG Bi
ng，CHEN Hai－ming，et al．Department of Clinical Laboratory，Qianxi'nan State Hospital，the7th Affiliated Hospital of ZunyiMedical College，Xingyi562400，China

Background and Objective The distribution of single nucleotide polymorphisms(SNPs)in protein coding sequence ismainly in clustered integration and may varieswith differentnationality regions and races.However，there are few reports about the distribution of SNPs in exon 14 and 16 in the coding sequence of prepro－epidermal growth factor (preproEGF)in Han People of Qianxinan Prefecture.In this study，we conducted researches on 35 Han people of Qianxinan Prefecture to investigate the distribution features of SNPs in exon 14 and 16 in the coding sequence of preproEGF．MethodsFour primerswere designed and synthesized，and PCR amplification and DNA sequencing of the productswere conducted on the sections of exon 14 and 16 in the coding sequence of preproEGF in 35 Han subjects;comparison was made between the sequencing results and data retrieved from dbSNP．Results Among the 35 Han subjects of Qinxinan Prefecture，13(37.1%) subjects had SNPs shown at 2 525 bp site in the coding sequence of preproEGF，and the genotypes were AG and GG，withfrequencies of 69.2%and 30.8%respectively and allele frequencies of A 34.6%and G 65.4%respectively;27(77.1%) subjects had SNPs shown at 2 576 bp site，and the genotypes were AG and AG，with frequencies being 66.7%and 33.3% respectively and allele frequencies being A 83.3%and G 16.7%respectively.In comparison，Han subjects of Beijing had an extra site of SNPs in exon 14，which was 2 619 bp site;subjects of Europe，the U.S.and some other nationalities had 7 extra sites of SNPs in exon 14，such as rs199935855，and they also had 6 extra sites of SNPs in exon 16;Han subjects of Qianxinan prefecture and Beijing had no SNPs in exon 16．Conclusion Among Han people of Qianxinan prefecture and Beijing and people of Europe，the U.S.and some other nationalities，the distribution of SNPs in exon 14 and 16 in the coding sequence of preproEGF varieswith differentethnic groups and races，which could be served as a reference for distinguishing different races or populations from different regions and even individual identification.The SNPswith featured distribution could be taken as genetic markers for further research of the relation between SNPs and diseases．

Han nationality;Guizhou;Polymorphism，single nucleotide;preproEGF;Multilocus sequence typing

R 394.5

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.29.020

2015－03－20;

2015－08－20)

(本文編輯:趙躍翠)

貴州省黔西南州醫(yī)院科研基金［(2009)84］

562400貴州省興義市，黔西南州人民醫(yī)院遵義醫(yī)學(xué)院第七附院檢驗(yàn)科(周白玉，張兵，陳海明，王興林，劉祖明，李方明);遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(劉金偉);海口保稅區(qū)遠(yuǎn)兮細(xì)胞分子技術(shù)應(yīng)用研發(fā)有限公司(楊紹華)

周白玉，562400貴州省興義市，黔西南州人民醫(yī)院遵義醫(yī)學(xué)院第七附院檢驗(yàn)科;E－mail:2578629971@qq.com