張 欣，樊 川，郭立姝，安 琦，殷 博，曹亞彬，孫宇峰

（黑龍江省科學(xué)院生物肥料研究中心，哈爾濱 150010）

秸稈腐熟劑生產(chǎn)菌HW1404的生產(chǎn)與應(yīng)用

張 欣，樊 川，郭立姝，安 琦，殷 博，曹亞彬，孫宇峰

（黑龍江省科學(xué)院生物肥料研究中心，哈爾濱 150010）

通過研究用于農(nóng)作物秸稈腐熟的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）HW1404的生產(chǎn)試驗與田間應(yīng)用效果，說明適宜的培養(yǎng)基組成是玉米面1.5%、豆粕粉0.5%、磷酸氫二鉀0.4%、碳酸鈣0.6%；在此條件下，在生產(chǎn)試驗中發(fā)酵液中有效活菌數(shù)達到109個/mL以上；在田間試驗中，使用秸稈腐熟劑產(chǎn)品，能夠提高秸稈的腐熟速度與效果。

秸稈腐熟；枯草芽孢桿菌；培養(yǎng)；優(yōu)化；應(yīng)用效果

近年來，隨著農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展和生活水平的提高，農(nóng)作物秸稈不再作為主要燃料，剩余秸稈也大量增加，為保證下季作物的正常生產(chǎn)，剩余秸稈絕大部分在田間焚燒，由此帶來巨大的環(huán)境問題。秸稈還田是土壤有機質(zhì)提升的重要技術(shù)措施，使用降解菌是加快秸稈腐解主要手段。科學(xué)工作者對此進行了大量研究，一些功能性菌株被選育出來［1-3］，并有大量的田間使用效果報道［4-10］。配合秸稈還田工作，使用秸稈腐熟劑對土壤物理化學(xué)性質(zhì)、微生態(tài)環(huán)境等有明顯改善，對下一季的作物穩(wěn)產(chǎn)、增產(chǎn)與減施化肥有顯著的效果。本項目在前期研究工作中，得到一株產(chǎn)果膠酶豐富的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）HW1404，并在實驗室研究中得到很好的結(jié)果，在此基礎(chǔ)上，本文將對產(chǎn)品生產(chǎn)與實際應(yīng)用部分進行總結(jié)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）HW1404本單位分離選育并保藏，化學(xué)試劑為分析純，玉米面、豆粕粉市場采購，生產(chǎn)試驗用磷酸氫二鉀、碳酸鈣為市場采購的工業(yè)產(chǎn)品。

1.2試驗方法

菌體計數(shù)采用平板計數(shù)法［11］；pH采用數(shù)顯型酸度計PHS-3C直接測定；總糖采用DNS比色法［12］；芽孢率測定方法采用90℃水處理法［11］；培養(yǎng)基優(yōu)選試驗采用正交試驗發(fā)（L934）；生產(chǎn)試驗在黑龍江省科學(xué)院生物肥料研究中心的2m3與5m3發(fā)酵設(shè)備中進行；貯存試驗采用強制高溫（30℃）法。

1.3田間試驗設(shè)計

1.3.1小區(qū)排列

小區(qū)面積42m2，設(shè)4處理，3重復(fù)，共12個小區(qū)，隨機區(qū)組排列。

1.3.2試驗處理

處理1：秸稈還田+常規(guī)施肥+2.0kg/畝秸稈腐熟劑。

處理2：秸稈還田+常規(guī)施肥+2.0kg/畝滅活秸稈腐熟劑（基質(zhì)對照）。

處理3：秸稈還田+常規(guī)施肥+清水（清水對照）。

處理4：秸稈還田+常規(guī)施肥（空白對照）。

1.4秸稈腐熟度測定——失重率法

以全國農(nóng)技推廣中心制定的“秸稈腐熟度測定方法——失重率法”為基礎(chǔ)，對試驗方法進行適當(dāng)修正完善，具體操作如下：選取粗細與長度接近的完整作物秸稈，將其裁成3～5 cm小段，稱取50 g左右放入尼龍網(wǎng)袋中，制備后的樣品進行編號，再置85℃下烘干處理6h后，準(zhǔn)確稱重并記錄每袋的初始重量NO0（平均值作為初始重量）。制備完成后的上述秸稈樣品（尼龍袋），與其他用于還田的粉碎秸稈一樣，分別置于不同處理的小區(qū)土表上（每組處理3個小區(qū)合計10袋、4組處理總計40袋），待完成試驗小區(qū)不同試驗處理后，尼龍樣品袋就近掩埋，表面覆土5～10cm，并做好標(biāo)記。分別在試驗的30d、60d、100d隨機取出樣品5袋，自來水沖洗直至滴下的水無色，然后將樣品置85℃烘干6h后，準(zhǔn)確稱重并記錄每袋的重量（NOx）。以試驗前后重量變化計算失重率。

2　結(jié)果與討論

2.1培養(yǎng)基組成優(yōu)選

基于降低生產(chǎn)成本的目的，以玉米粉、豆粕粉替代葡萄糖、酵母膏、牛肉膏等昂貴的化學(xué)試劑，對枯草芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)配方進行了優(yōu)化，試驗采用正交試驗法（L934）進行，結(jié)果表明（表1、圖1），各項試驗的因子中，含豐富氮源的豆粕粉對菌體的生長影響最大，其濃度的增加顯著提高了有效活菌數(shù)，而其他培養(yǎng)基成分都展示出有一個適宜的濃度，過高或過低的濃度不利于菌體數(shù)量的提高；正交試驗的結(jié)果也表明，以試驗4的培養(yǎng)結(jié)果最佳，在驗證試驗中，以最佳培養(yǎng)基配方組成的培養(yǎng)基，平均有效活菌數(shù)8.7×109個/mL，高于表1中的實驗結(jié)果，達到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)水平。

表1　L934正交表的試驗設(shè)計（水 1 000mL）Tab.1 The Orthogonal experimental design（water 1000mL）

圖1　單因子直觀分析Fig.1 The visual analysis of single factor

2.2生產(chǎn)試驗結(jié)果

以優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為培養(yǎng)基質(zhì)，在溫度36±1℃、通風(fēng)量1：1的條件下，分別在2m3和5m3的發(fā)酵罐中進行生產(chǎn)試驗（表2）。培養(yǎng)過程中由于碳酸鈣的緩沖作用，pH穩(wěn)定在7.1～7.4，滿足了枯草芽孢桿菌對pH的要求；總糖的變化隨培養(yǎng)時間的延長而被消耗，同比菌體的數(shù)量也在逐步升高；在培養(yǎng)結(jié)束時，枯草芽孢桿菌的濃度芽孢率分別達到24.5%和20.5%，菌體的濃度分別達到8.2×109個/mL與7.3× 109個/mL。經(jīng)過對發(fā)酵液適當(dāng)?shù)恼{(diào)質(zhì)后，分裝到500mL塑料瓶中，在30℃下進行強制高溫貯存試驗，結(jié)果表明（表3），貯存前兩周有效活菌數(shù)迅速下降，芽孢率迅速上升，有輕微染菌出現(xiàn)；后兩周有效活菌數(shù)與芽孢率趨于穩(wěn)定，有效活菌數(shù)保持在1.4×109個/mL以上，芽孢率穩(wěn)定在76.5%～78.3%，雜菌污染也得到控制。

表2　枯草芽孢桿菌HW1404生產(chǎn)試驗結(jié)果Tab.2　The culture results of production test forBacillus subtilisHW1404

表3　枯草芽孢桿菌HW1404的強制高溫（30℃）貯存試驗Tab.3 high temperature storage test ofbacillus subtilisHW1404

2.3田間應(yīng)用效果

可以看出，隨時間的推移不同處理間在外觀形態(tài)上表現(xiàn)出區(qū)別（表4），與其他三組對照相比，處理1在秸稈轉(zhuǎn)色、菌斑面積、韌性等能夠代表腐爛速度與效果的外觀表現(xiàn)方面，優(yōu)勢明顯。處理4由于前期缺水嚴重，前期秸稈形態(tài)變化不大，整體腐解速度最慢，至試驗期結(jié)束時，內(nèi)心有一定的腐解，外皮變軟，秸稈仍有一定的韌性，不易折斷。處理3由于前期有水分補充，腐解速度前期略快于處理4，進入7月雨季以后，兩者的腐解速度與效果區(qū)別不大。處理2是滅活后的秸稈腐熟劑產(chǎn)品，有微量的養(yǎng)分補充，前期秸稈表面上微生物生長狀態(tài)好于處理3與處理4，霉點出現(xiàn)與處理1接近，但后期區(qū)別不大。處理1產(chǎn)品中含有枯草芽孢桿菌，是腐解效果最好的處理組，經(jīng)過四個月的腐熟至9月中旬，處理1秸稈僅存外形，內(nèi)心完全腐爛，表皮的韌性也大幅度降低，腐熟效果很好。

表4　田間試驗秸稈腐熟直觀比較Tab.4 visual comparison of straw rotten degree test

為進一步了解秸稈腐熟劑對秸稈的腐解作用效果，采用失重率法測試了不同處理對秸稈腐熟度的影響。對試驗數(shù)據(jù)進行的方差分析結(jié)果（表5、表6、表7）表明，處理間差異遠大于重復(fù)間差異，F(xiàn)＞F0.01，達到極顯著水平，表明不同的處理對秸稈腐熟產(chǎn)生極顯著的影響。隨秸稈田間腐熟時間的延長，F(xiàn)值逐漸變小，表明處理間的處理效果逐漸接近。隨后進行的多重比較結(jié)果表明，在30d和60d時，處理1與其他處理差異極顯著，而處理2、處理3之間差異不顯著。對田間腐熟結(jié)果的失重率分析結(jié)果表明，30d時，處理1失重率達到28.04%，比處理2高出14.24%、比處理3高出15.57%、比處理4高出18.34%；60d時，處理1失重率達到37.39%，比處理2高出12.86%、比處理3高出13.16%、比處理4高出18.79%。失重率試驗結(jié)果表明，使用秸稈腐熟劑加快了田間秸稈腐熟速度。

表5　失重率試驗殘重測定結(jié)果Tab.5 residual content in the weight loss test

表6　秸稈腐熟度試驗結(jié)果方差分析表Tab.6 variance analysis in straw rotten degree test

表7　秸稈腐熟度試驗結(jié)果多重比較表Tab.7 Multiple comparison of straw rotten degree test

3　討論

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）HW1404的培養(yǎng)特性比較普通，沒有特殊的生長限制因素，可以在玉米粉——豆粕粉組成的培養(yǎng)基中正常生長并達到較高的發(fā)酵水平。貯存試驗是在30℃下進行的，表明經(jīng)過適當(dāng)處理的發(fā)酵液貯存至28d時，各項指標(biāo)能夠達到國家標(biāo)準(zhǔn)GB20287中的要求，符合產(chǎn)品化的基本條件。在失重率試驗中，與基質(zhì)對照、清水對照與空白對照相比，使用菌劑處理的處理1組，100d后失重率分別提高12.74%、13.71%與15.31%；在試驗區(qū)的秸稈腐熟試驗中，使用秸稈腐熟劑的試驗組也在秸稈表面顏色、韌性與強度、表面菌斑面積等體現(xiàn)秸稈腐熟程度的指標(biāo)中表現(xiàn)出優(yōu)勢。表明了在秸稈還田中使用本項產(chǎn)品能夠提高秸稈的腐熟速度與效果。

［1］ 白洪志，楊謙，張魯進.纖維素降解菌簡青霉H.11的篩選及酶學(xué)特性的研究［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2007，22（3）：160-162.

［2］ 蔡興旺，路福平，杜連祥.兼性厭氧纖維素降解菌的篩選和產(chǎn)酶研究［J］.工業(yè)微生物，2005，35（1）：6-9.

［3］ 鄧勛，宋瑞清，閔凱，等.高效選擇性降解稻草木質(zhì)素的菌株及其產(chǎn)酶特性的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2009，31（4）：390-397.

［4］ 柴文俊.“榕風(fēng)l號”生物菌劑處理作物秸稈還田實驗示范［J］.云南農(nóng)業(yè)科技，2010，（06）：13.

［5］ 杜守宇，田恩平，溫敏，等.秸稈覆蓋還田的整體功能效應(yīng)與系列化技術(shù)研究［J］.干早地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，1994，12（2）：88，94.

［6］ 顧紹軍，王兆民，孫皓，等.試論秸稈還田對改善土壤微生態(tài)環(huán)境的作用［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，（06）：56-58.

［7］ 顧玉珍，李寧.秸稈助降解微生物菌劑應(yīng)用效果研究［J］.上海農(nóng)業(yè)科技，2002，（06）：97-98.

［8］ 洪春來，魏幼璋，黃錦法，等.秸稈全量直接還田對土壤肥力及農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的影響研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2003，29（6）：627-633.

［9］ 黃琴.作物秸桿還田對土壤養(yǎng)分含量的影響［J］.石河子大學(xué)學(xué)報，2006，24 （3）：276-279.

［10］ 李煥珍，張忠涂，楊偉奇，等.玉米秸稈直接還田培肥效果的研究［J］.土壤通報，1996，27（5）：213-215.

［11］ 周德慶.微生物學(xué)實驗手冊［K］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986.

［12］ 寧正祥.食品成分分析手冊［K］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1997.

The Production and Application of Bacillus Subtilis HW1404 for the Straw Rotten

ZHANGXin,FANChuan,GUOLi-shu,ANQi,YINBo,CAOYa-bin,SUNYu-feng
（Research center ofMicrobial fertilizer HeilongjiangProvincial AcademyofSciences,Harbin 150010,China）

The optimal cultural medium composition was 1.5%of the cornmeal,0.5%of the soybean flour,0.4%of dipotassium hydrogen phosphate，0.6%of calcium carbonate for Bacillus subtilis HW1404 used in the strawrotten，which has been approved by production testing and field trials；In the product testing，the total number of the bacteria is 109/mL or more under this condition；In field trials，the use of bacillus subtilis HW1404 can improve the speed and effect ofstrawrotten.

Strawrotten；Bacillus subtilis；Cultivation；Optimization；Effect.

S511

A

1674-8646（2015）12-0012-04

2015-09-13

哈爾濱市科技創(chuàng)新人才專項（14044RFXYJ008）

張欣（1982-），女，助理研究員，從事農(nóng)業(yè)微生物研究與應(yīng)用。

孫宇峰（1964-），男，研究員級高級工程師，從事農(nóng)業(yè)微生物研究與應(yīng)用，e-mail：sunyf888@163.com。