陳英，張西英（新疆兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆五家渠831300）

紅顏草莓離體培養(yǎng)技術(shù)初探

陳英，張西英
（新疆兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆五家渠831300）

本文以紅顏草莓葉片和匍匐莖為外植體，進(jìn)行無(wú)毒苗離體培養(yǎng)，通過(guò)不同滅菌和誘導(dǎo)處理，得出組織培養(yǎng)方法誘導(dǎo)草莓植株再生的適宜方案。結(jié)果表明，幼嫩葉片和匍匐莖分別采用75%酒精浸泡20s和30s后用無(wú)菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5min后用無(wú)菌水漂洗5遍后再用濾紙迅速吸干接種，獲得無(wú)菌株成功率達(dá)90%以上；葉片誘導(dǎo)分化適宜培養(yǎng)基為6-BA0.2mg/L+IBA0.1mg/L+GA30.1mg/L；匍匐莖尖誘導(dǎo)分化適宜培養(yǎng)基為6-BA0.1mg/L+IBA1mg/L。

草莓；幼嫩葉片；莖尖；離體培養(yǎng)

草莓是薔薇科宿根多年生常綠草本植物，具有適應(yīng)性廣，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，結(jié)果多，果實(shí)顏色鮮艷，肉質(zhì)細(xì)嫩柔軟多汁，甜酸適口，風(fēng)味獨(dú)特，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的特點(diǎn)，是人們喜愛(ài)的果品之一。在世界漿果類(lèi)水果生產(chǎn)中，草莓的栽培面積和產(chǎn)量?jī)H次于葡萄，為世界性第二大漿果水果[1]，近年來(lái)，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)草莓含有鞣花單寧、花青素苷、天竺葵素、矢車(chē)菊素等類(lèi)黃酮生物活性物質(zhì)，能在很大程度上防止心腦血管、癌癥和老年神經(jīng)變性等疾病的發(fā)生，草莓也因這些抗氧化活性物質(zhì)所具有的獨(dú)特醫(yī)療保健功能愈加受到消費(fèi)者青睞[2-4]。草莓生產(chǎn)中主要靠匍匐莖壓枝和分枝繁殖，在長(zhǎng)期的生產(chǎn)和繁殖過(guò)程中，草莓極易感染和傳染病毒，造成多種病毒病的侵染率不斷提高[5]，病毒對(duì)草莓的危害十分嚴(yán)重，病毒導(dǎo)致減產(chǎn)可達(dá)30%～80%[6]，目前，草莓植株體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)62種病毒，其中，在我國(guó)危害大，分布廣，造成損失嚴(yán)重的主要有草莓皺縮病毒、斑駁病毒、輕型黃邊病毒和鑲脈病毒[7]。這些病毒多是蚜蟲(chóng)傳播，而草莓自身對(duì)病毒沒(méi)有免疫能力。病毒容易引起葉片黃化或葉緣失綠，幼葉反卷，成熟葉片產(chǎn)生壞死條斑或葉脈壞死、扭曲，甚至出現(xiàn)葉片枯死、植株矮化、老葉變紅，造成草莓長(zhǎng)勢(shì)極弱，產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降，且草莓病毒病會(huì)隨著草莓營(yíng)養(yǎng)繁殖而代代相傳。到目前為止，尚沒(méi)有特效藥或特效方法治愈草莓病毒病。

采用莖尖培養(yǎng)法進(jìn)行無(wú)毒苗的培育，是目前世界上獲得草莓無(wú)毒苗最普遍且最有效的方法，采用無(wú)毒材料培養(yǎng)的秧苗無(wú)病毒，生長(zhǎng)健壯，葉片濃綠，繁殖快，果實(shí)品質(zhì)較好，產(chǎn)量較高。本試驗(yàn)以“紅顏”品種為試材，探討以葉片、莖尖離體培養(yǎng)再生植株獲得草莓無(wú)毒苗的技術(shù)方法，不僅為建立草莓脫毒苗離體培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)，而且也為草莓種苗脫毒和大規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為第六師國(guó)家科技園區(qū)溫室大棚栽培的“紅顏”草莓品種。

1.2 不同外置體處理

表1 不同外植體滅菌處理min

草莓植株毛面遍布絨毛，從田間選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、典型性狀優(yōu)良的植株為母株，剪取剛抽出的匍匐莖莖尖約3cm和幼嫩的葉片，分別用1%洗潔精水溶液浸泡5min，并用玻璃棒輕微攪動(dòng)后，再用自來(lái)水沖洗30min，無(wú)菌水沖洗1遍后移入超凈工作臺(tái)。根據(jù)表1對(duì)不同外植體進(jìn)行滅菌處理，將匍匐莖尖和葉片分別放入滅菌燒杯中。倒入75%酒精分別浸泡20s、30s，無(wú)菌水沖洗3次，轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液輕微攪動(dòng)4min、5min、8min，用無(wú)菌水沖洗5次，用濾紙迅速吸干水分。各處理分別接種50個(gè)外植體，10d后統(tǒng)計(jì)外植體數(shù)量，并對(duì)外植體損傷情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)

1.3.1 葉片離體再生

將消毒后的葉片切成5mm左右小塊作為外植體，誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比（見(jiàn)表2）。

表2 葉片離體再生mg/L

每瓶放置1片外植體，放置于恒溫培養(yǎng)室，在22～25°C，光照2000-3000Lx，光照時(shí)間16h條件下進(jìn)行培養(yǎng)，2周后葉片周?chē)霈F(xiàn)愈傷組織，30d后有綠色芽點(diǎn)。

1.3.2 匍匐莖尖誘導(dǎo)分化

表3 匍匐莖尖誘導(dǎo)分化mg/L

在超凈工作臺(tái)上，40倍顯微鏡下，剝?nèi)≠橘肭o尖（帶1～2個(gè)葉原基）。按照表3對(duì)匍匐莖尖誘導(dǎo)分化處理，每瓶接種1個(gè)莖尖外植體，接種好后放置于恒溫培養(yǎng)室，在溫度22～25°C，光照2000～3000Lx，光照時(shí)間16h條件下進(jìn)行培養(yǎng)，仔細(xì)觀察生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，在1周后綠點(diǎn)慢慢長(zhǎng)大，4周后出現(xiàn)叢生芽點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體滅菌結(jié)果

草莓的幼嫩葉片和匍匐莖都能誘導(dǎo)分化，從表4可以看出，葉片采用A2處理時(shí)外植體滅菌效果好，損傷程度低。匍匐莖采用A5外植體滅菌效果好，損傷程度低。即：葉片采用75%酒精浸泡20s，用無(wú)菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5min后用無(wú)菌水漂洗5遍處理效果較好；匍匐莖采用75%酒精浸泡30s，用無(wú)菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5min后用無(wú)菌水漂洗5遍的處理效果較好。

2.2 不同外植體誘導(dǎo)分化結(jié)果

從表5可以看出，B1、B2、B3叢生的芽點(diǎn)少，誘導(dǎo)率低于50%，而葉片誘導(dǎo)分化B4芽點(diǎn)多，長(zhǎng)勢(shì)良好，B6芽點(diǎn)也多，但B6出現(xiàn)幼苗有輕度的玻璃化，因此，以B4最好。

表4 不同外植體滅菌處理

表5 葉片離體再生

表6 匍匐莖尖誘導(dǎo)分化

從表6可以看出，C1、C2的誘導(dǎo)率偏低，C4、C5、C6的誘導(dǎo)率低于90%，C3匍匐莖誘導(dǎo)分化大于90%，芽點(diǎn)狀態(tài)較好，因此，以C3處理誘導(dǎo)分化效果較好。

3 小結(jié)

（1）本文研究表明，葉片采用75%酒精浸泡20s，用無(wú)菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5min后用無(wú)菌水漂洗5遍后用濾紙迅速吸干接種，成功率達(dá)到90%以上，匍匐莖采用75%酒精浸泡30s，用無(wú)菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5min后用無(wú)菌水漂洗5遍后用濾紙迅速吸干接種，成功率達(dá)到93%以上。（2）細(xì)胞分裂素能促進(jìn)植物體細(xì)胞的分裂以及器官誘導(dǎo)生長(zhǎng)，從而對(duì)不定芽的產(chǎn)生獲得積極的影響，葉片誘導(dǎo)分化以B4最好，即葉片誘導(dǎo)培養(yǎng)基6-BA 0.2mg/L+IBA0.1mg/L+GA30.1mg/L。匍匐莖誘導(dǎo)分化C3最好，即6-BA0.1mg/L+IBA1mg/L。

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2015—03—23