劉俊紅+楊紅霞+李子健等

摘要： 狗牙根中含有豐富的纖維素，經(jīng)纖維素酶酶解形成的還原糖通過(guò)嗜鞣管囊酵母發(fā)酵可以得到生物乙醇。以狗牙根為原料，分析嗜鞣管囊酵母發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)時(shí)間、接種量、pH值、溫度等因素對(duì)乙醇得率的影響，探索最佳的發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明， pH值為5 0、溫度40 ℃、嗜鞣管囊酵母菌液（1億個(gè)/mL）接種量0 073 0 mL/g、發(fā)酵時(shí)間 60 h 為生產(chǎn)乙醇的最佳條件，此時(shí)乙醇濃度為5 146 mg/mL。

關(guān)鍵詞： 生物乙醇；嗜鞣管囊酵母；發(fā)酵；纖維素；狗牙根

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ352 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0384 02

21世紀(jì)，社會(huì)經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展，對(duì)能源的需求也越來(lái)越大，[JP+1]以煤炭為主的能源消耗結(jié)構(gòu)是我國(guó)空氣質(zhì)量不斷惡化的主要原因 [1]，尋找新的替代能源是當(dāng)務(wù)之急。生物乙醇是一種新型能源，然而最初生物乙醇的生產(chǎn)主要以玉米、小麥為原料，不僅消耗大量農(nóng)產(chǎn)品，成本高，而且威脅到國(guó)家的糧食安全，影響糧食的正常供應(yīng)，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品價(jià)格上漲等連鎖反應(yīng) [2-3]。因此，第2代利用纖維素生產(chǎn)生物乙醇的技術(shù)引起較大關(guān)注 [4]，這不僅可以大大緩解能源壓力，也可以避免人和能源之間的爭(zhēng)糧現(xiàn)象。狗牙根含有豐富的纖維素，經(jīng)稀酸預(yù)處理，在纖維素酶和木聚糖酶作用下可降解得到還原糖，接種嗜鞣管囊酵母發(fā)酵可制備生物乙醇。本試驗(yàn)通過(guò)研究pH值、時(shí)間、溫度、嗜鞣管囊酵母接種量等因素對(duì)狗牙根糖化液發(fā)酵產(chǎn)生乙醇得率的影響，通過(guò)正交試驗(yàn)探索狗牙根糖化液制備乙醇的最佳發(fā)酵條件，為狗牙根的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1 1 試驗(yàn)材料

從河南城建學(xué)院圖書(shū)館后的山腳下采集成熟的狗牙根（Bermuda grass）植株，洗凈烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，密封保存，備用。

1 2 主要試劑

葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉，天津市博迪化工有限公司產(chǎn)品；酵母膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；纖維素酶、木聚糖酶，和氏璧生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1 3 試驗(yàn)儀器

QE-100屹立高速中藥粉碎機(jī)，武義縣屹立工具有限公司生產(chǎn)；FA1004B電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；HWS28型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；LDZX-75KBS立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；PHSJ-3F pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；ZFD-A5250生化培養(yǎng)箱、HZQ-L恒溫培養(yǎng)搖床，上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)。

1 4 試驗(yàn)方法

1 4 1 pH值測(cè)定 稱(chēng)取狗牙根粉末1 g，加入 1%稀鹽酸，120 ℃反應(yīng)60 min；調(diào)節(jié)pH值為4 2，加入木聚糖酶和纖維素酶酶解，測(cè)還原糖的量；根據(jù)還原糖含量配制液體培養(yǎng)基，分別調(diào)pH值為4 0、4 5、5 0、5 5、6 0；滅菌，接種嗜鞣管囊酵母菌液（1億個(gè)/mL）0 094 9 mL/g，30 ℃搖床培養(yǎng)36 h；蒸餾測(cè)定乙醇含量。

1 4 2 溫度測(cè)定 稱(chēng)取狗牙根粉末1 g分裝在試管中，加入 1%稀鹽酸，120 ℃反應(yīng)60 min；調(diào)節(jié)pH值為4 2，加入木聚糖酶和纖維素酶酶解，根據(jù)還原糖含量配制液體培養(yǎng)基，調(diào)pH值為5 5；滅菌，接種菌液0 094 9 mL/g，分別放于20、25、30、35、40 ℃搖床中培養(yǎng)36 h；蒸餾測(cè)定乙醇含量。

1 4 3 接種量測(cè)定 稱(chēng)取狗牙根粉末1 g分裝在試管中，加入 1%稀鹽酸，120 ℃反應(yīng)60 min；調(diào)節(jié)pH值為4 2，加入木聚糖酶和纖維素酶酶解，根據(jù)還原糖含量配制液體培養(yǎng)基，調(diào)pH值為5 5；滅菌，分別接種菌液0 029 2、0 051 1、0 073 0、0 094 9、0 116 8 mL/g，放于30 ℃搖床中培養(yǎng)36 h；蒸餾測(cè)定乙醇含量。

1 4 4 時(shí)間測(cè)定 稱(chēng)取1 g狗牙根粉末分裝在試管中，加入 1%稀鹽酸，120 ℃反應(yīng)60 min；調(diào)節(jié)pH值為4 2，加入木聚糖酶和纖維素酶酶解，根據(jù)還原糖含量配制液體培養(yǎng)基，調(diào)pH值為5 5；滅菌，接種菌液0 094 9 mL/g，放于30 ℃搖床中分別培養(yǎng)36、48、60、72、84 h；蒸餾測(cè)定乙醇含量。

1 4 5 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)（表1），分析狗牙根纖維素發(fā)酵制備生物乙醇的最優(yōu)工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2 1 單因素試驗(yàn)

2 1 1 pH值對(duì)嗜鞣管囊酵母發(fā)酵產(chǎn)量的影響 由圖1可見(jiàn)，嗜鞣管囊酵母適于在pH值為 4 5～5 0的酸性環(huán)境中生長(zhǎng)；pH值為5 0時(shí)，生產(chǎn)出的乙醇濃度相對(duì)較高，為 2 259 mg/mL。pH值改變不太劇烈時(shí)，酶雖未變性，但會(huì)影響酶分子活性部位有關(guān)基團(tuán)的解離，從而進(jìn)一步影響酶與底物的結(jié)合或催化，使酶活性降低，也可能影響中間絡(luò)合物ES的解離狀態(tài)，不利于催化生成產(chǎn)物 [5]。因此，低于或高于最適pH值，都會(huì)影響乙醇的產(chǎn)量。

2 1 2 溫度對(duì)嗜鞣管囊酵母發(fā)酵產(chǎn)量的影響 溫度能夠影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)功能及細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而細(xì)胞膜的流動(dòng)性及完整性均可影響微生物的生長(zhǎng)、繁殖和代謝 [6]。由圖2可見(jiàn)，溫度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，進(jìn)而影響乙醇的得率；35 ℃時(shí)，菌株活力相對(duì)最為活躍，細(xì)胞膜的流動(dòng)性達(dá)到最佳狀態(tài)，此時(shí)發(fā)酵液中乙醇濃度相對(duì)較高，為4 076 mg/mL；20 ℃時(shí)，菌種的發(fā)酵能力欠佳，生長(zhǎng)速度比較緩慢，生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，積累的代謝產(chǎn)物乙醇產(chǎn)量相對(duì)較低。2 1 3 接種量對(duì)嗜鞣管囊酵母發(fā)酵產(chǎn)量的影響 由圖3可見(jiàn)，隨著接種量增加，乙醇得率也逐漸升高，接種量為 0 094 9 mL/g 時(shí)，乙醇的得率相對(duì)最高，為1 02 mg/mL；接種量過(guò)低，由于沒(méi)有足夠的酵母細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)未得到充分利用，從而影響乙醇的得率。由于接種到新鮮培養(yǎng)液的種子細(xì)胞，一時(shí)缺乏分解或催化有關(guān)底物的酶或輔酶，或是缺乏充足的中間代謝物，在實(shí)際菌種生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成有關(guān)的中間代謝物 [7-8]，這就需要有一段用于適應(yīng)的時(shí)間，出現(xiàn)延滯期。在發(fā)酵工業(yè)中，為縮短延滯期以縮短生產(chǎn)周期，通常都會(huì)采用較大的接種量。但是，如果接種量過(guò)高，培養(yǎng)基既要滿足菌體生長(zhǎng)，又要用于生產(chǎn)乙醇，反而會(huì)使乙醇的產(chǎn)量下降。2 1 4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)嗜鞣管囊酵母發(fā)酵產(chǎn)量的影響 菌種發(fā)酵生產(chǎn)乙醇需要一個(gè)合理的發(fā)酵周期，發(fā)酵時(shí)間直接影響著乙醇的產(chǎn)量。由圖4可見(jiàn)，嗜鞣管囊酵母發(fā)酵培養(yǎng)的最佳時(shí)間為60 h，此時(shí)，發(fā)酵液中乙醇濃度為相對(duì)最高，為 2 442 mg/mL；發(fā)酵72 h時(shí)，發(fā)酵液中乙醇濃度有所降低，這是因?yàn)槭洒饭苣医湍赴l(fā)酵初期以發(fā)酵液中的葡萄糖為碳源，酵母不斷代謝葡萄糖發(fā)酵成乙醇，而管囊酵母同化乙醇的能力很強(qiáng) [9]；發(fā)酵超過(guò)72 h，發(fā)酵液中的葡萄糖含量減少，酵母可能開(kāi)始利用乙醇為碳源來(lái)維持自身的生長(zhǎng)和繁殖。endprint

2 2 正交試驗(yàn)與工藝優(yōu)化

由表2可見(jiàn)，影響乙醇產(chǎn)物得率的最關(guān)鍵因素是發(fā)酵溫度；嗜鞣管囊酵母發(fā)酵狗牙根生成乙醇的最佳條件為A2B3C1D2，即pH值為5 0、溫度40 ℃、接種量0 073 0 mL/g、時(shí)間60 h，此時(shí)，乙醇濃度最高，為5 146 mg/mL。

3 討論

目前，纖維素生產(chǎn)乙醇的研究主要集中于預(yù)處理方法的選擇、工藝的優(yōu)化、酶水解成本的降低及乙醇轉(zhuǎn)化率的提高。利用預(yù)處理和雙酶降解纖維素后的還原糖為原料，接種單一的嗜鞣管囊酵母發(fā)酵制備乙醇，乙醇的得率往往相對(duì)較低，而多菌種混合發(fā)酵可充分利用培養(yǎng)基中的有效成分，提高乙醇的得率，這為進(jìn)一步提高產(chǎn)量提供了依據(jù) [10]。

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