謝炎福　杜苗苗

摘要： 以紅曲霉作為發(fā)酵菌種，中藥虎杖作為發(fā)酵基質進行了雙向發(fā)酵試驗。結果表明，虎杖對于紅曲霉的生長和次級代謝產物Monacolin K的積累具有促進作用，發(fā)酵后虎杖中白藜蘆醇苷、結合大黃素含量降低，而白藜蘆醇、大黃素含量升高；經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化，雙向發(fā)酵的最佳工藝條件為：虎杖用量4%，發(fā)酵溫度28 ℃，接種量9%，發(fā)酵6 d，發(fā)酵后虎杖中白藜蘆醇含量達1 29%，大黃素含量0 67%，Monacolin K含量0 48 mg/L，綜合得分為0 775。與未發(fā)酵組相比，白藜蘆醇含量提高了3～4倍，大黃素含量提高了約1倍。

關鍵詞： 紅曲霉；虎杖；雙向發(fā)酵；白藜蘆醇；Monacolin K

中圖分類號：R282 71；R285 5 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0272-04

虎杖是我國的一種傳統(tǒng)中藥，其主要活性成分為以白藜蘆醇為代表的芪類化合物和大黃素為代表的蒽醌類化合物，白藜蘆醇具有降壓降脂、預防心腦血管疾病、抗癌、增強免疫力、延年益壽等多重功效 [1]，在花生、葡萄等70多種植物中廣泛存在，但以虎杖中含量較高，一般在0 2%左右，而其糖苷虎杖苷含量則高達2% [2]，白藜蘆醇的生物活性是虎杖苷的數(shù)十倍 [3]。目前，白藜蘆醇主要采用有機溶劑萃取 [4]，有機溶劑毒性大，在提取物中均有或多或少的殘留，若作為藥物和保健品來使用，無論從健康角度或消費者心理方面均不太容易接受，且植物藥材大部分有效成分包含在植物細胞壁中，一般的有機溶劑不易破壞，提取效率低，所以采用綠色安全的提取方法并將虎杖苷轉化為更具活性的白藜蘆醇成為現(xiàn)在的研究熱點之一。采用酶解法環(huán)境友好 [5]，常溫常壓下即可完成，但酶的價格高昂。彭源德等、龔云杰等分別利用黑曲霉、酵母菌對虎杖進行發(fā)酵，達到和超過了酶解法的效果 [6-7]，顯示出生物發(fā)酵法在虎杖活性成分轉化方面的巨大潛力，但他們僅研究了真菌對虎杖的單向作用，菌種本身沒有生物活性成分產生，并且部分菌種不是生物安全菌種。所以，如果能夠采用具有生物安全性，且在對虎杖進行發(fā)酵的同時產生類似活性物質的菌種進行虎杖、真菌的雙向發(fā)酵，產品僅需進行簡單加工或濃縮即可，將大大減輕后續(xù)處理的壓力。紅曲霉的使用在我國具有悠久的歷史，廣泛應用于食品、醫(yī)藥等多個領域，紅曲霉能產生Monacolin K（莫納可林K）、γ-氨基丁酸等多種生物活性成分，具有很高的保健及藥用價值 [8]。紅曲霉和虎杖在藥性機理上具有一定的相似性，紅曲霉能產生淀粉酶、葡萄糖苷酶、纖維素酶等豐富的酶系，能有效破除植物類中藥細胞壁和果膠類物質形成的物理屏障，使有效活性成分溶出，且具有打斷β糖苷鍵，將虎杖苷和結合大黃素轉化為白藜蘆醇和游離大黃素的潛力 [9]。因此，將紅曲霉與虎杖一起共同構建雙向發(fā)酵體系產生的藥性菌質比兩者分別入藥更能得到優(yōu)勢互補的功效。本次研究在前期中藥篩選和紅曲霉菌株定向誘變的基礎上，利用虎杖作為紅曲霉發(fā)酵的藥性基質，旨在探討通過紅曲霉發(fā)酵虎杖達到提高白藜蘆醇、大黃素含量和紅曲霉中Monacolin K等有效活性成分含量的目的，并進行發(fā)酵條件的初步優(yōu)化，為紅曲霉藥性基質雙向發(fā)酵的研究打下基礎。

1 材料與方法

1 1 試驗材料

1 1 1 紅曲霉（Monascus）：為本實驗室保存菌種，經(jīng)過紫外、化學誘變獲得（見圖1）。

1 1 2 虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc ）：購自洛陽醫(yī)藥城，于60 ℃干燥箱中烘干至恒質量，用實驗室小型粉碎機粉碎過120目篩備用。

1 1 3 發(fā)酵培養(yǎng)基：參照文獻[10]的配方進行適當?shù)母膭?，葡萄?0 g，虎杖粉30 g，硝酸鈉3 g，酵母提取物1 g，磷酸氫二鉀1 g，7水合硫酸鎂0 5 g，氯化鉀0 5 g，7水合硫酸亞鐵001 g，pH值5 6，用自來水定容至1 L。

1 2 試驗方法

1 2 1 發(fā)酵種子液的制備 將經(jīng)活化的紅曲霉斜面孢子用無菌水洗下，倒入含0 05%吐溫80生理鹽水的三角瓶中，三角瓶中預先裝有數(shù)十粒玻璃珠，在搖床上振蕩，充分打散孢子，制成孢子濃度為1×106個/mL的孢子懸液，即為紅曲霉種子液。

1 2 2 發(fā)酵方法和流程 將80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，于121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻后按照6%的比例接入預先制好的紅曲霉孢子懸液，在搖床上180 r/min、30 ℃培養(yǎng)3 d，降低溫度至28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)一定天數(shù)，隔天定時帶瓶稱質量，測量各項指標，發(fā)酵結束后，將發(fā)酵液過濾，稱量紅曲干質量。發(fā)酵流程如下：

1 2 3 單因素試驗 單因素試驗設計包括接種量：0%、3%、6%、9%、12%；虎杖添加量：0%、1%、2%、3%、4%、5%；發(fā)酵

[ （W7][TPXYF1A TIF]

時間：30 ℃發(fā)酵3 d后，28 ℃條件下繼續(xù)發(fā)酵一定天數(shù)；每個處理3個重復，分別測定紅曲質量、Monacolin K、白藜蘆醇等的含量做為評價指標，培養(yǎng)方法同上，每次改變1個條件，測定不同條件下各指標的變化情況，以上次試驗確定的最優(yōu)條件作為下次單因素試驗的基礎。

1 2 4 正交試驗 選用L9（34）正交表，在單因素試驗的基礎上，選取接種量、發(fā)酵時間、虎杖用量3個培養(yǎng)條件進行優(yōu)化（表1），并通過測定白藜蘆醇、Monacolin K等的含量高低確定綜合最優(yōu)發(fā)酵條件。

1 3 測定及分析方法

紅曲質量稱量：參照陳云的氨基葡糖法 [11]略有改動。

紅曲色素的去除：參照張小茜等的方法 [12]，將三角瓶中的發(fā)酵液連同殘渣一起倒入大的培養(yǎng)皿中，60 ℃烘干、研磨，將研磨后的粉末用75%的乙醇回流提取3 h，更換乙醇，再提取2次，合并提取后的乙醇溶液，濃縮，在裝有氧化鋁的層析柱上層析，除去紅色素，收集去除紅色素的層析液，濃縮至約 80 mL，于100 mL容量瓶中用75%乙醇定容至刻度，備用。

Monacolin K測定：參照田潔等的方法 [13]，將上述得到的層析液進行適當稀釋，在236 nm波長處測量吸光度。

總大黃素的測定：參照高言明等 [14]和李衛(wèi)先等 [15]的方法略有改動，取適量除去紅色素的層析液，回收乙醇至無醇味，得醇浸膏，取醇浸膏0 5 g，加入2 5 mol/L的硫酸40 mL，超聲振蕩10 min至完全溶解，用氯仿回流提取2 h，反復3次，合并氯仿溶液，回收氯仿得紅棕色物質，加入適量乙醚溶解，加入5%的碳酸鈉溶液萃取3次，合并萃取液，加鹽酸調整pH值為2～3，析出沉淀，抽濾，加入含0 5%乙酸鎂的甲醇溶液中，用25 mL容量瓶定容至刻度，在510 nm處測定吸光度，計算總大黃素的含量。

游離大黃素含量的測定：除不加硫酸外，其他同總大黃素的測定。

白藜蘆醇的測定：參照倪網(wǎng)東等的方法 [16]略有改動，取適量除去紅色素的層析液，回收乙醇至無醇味，得醇浸膏，取醇浸膏0 5 g，用乙醚回流提取2 h，反復3次，合并乙醚溶液，回收乙醚，用95%的乙醇溶液溶解殘渣并用5 mol/L NaOH滴定至pH值為8，分別測定波長314 nm和波長318 nm時候的吸光度。

白藜蘆醇苷的測定：參照李夢青的方法 [17]略有改動，將上述白藜蘆醇提取后的殘渣，用乙酸乙酯提取3次，合并萃取液，在波長325 nm處測定吸光度。

總的測定流程如下：

1 4 數(shù)據(jù)處理

總大黃素含量=（總大黃素濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積）/虎杖質量×100%；

游離大黃素含量=（游離大黃素濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積）/虎杖質量×100%；

結合大黃素含量=總大黃素含量-游離大黃素含量；

白藜蘆醇=（白藜蘆醇濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積）/虎杖質量×100%；

白藜蘆醇苷=（白藜蘆醇苷濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積）/虎杖質量×100%。

所有數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行方差分析，多重比較采用LSD法。

1 5 綜合指標評分的計算

中藥成分復雜，臨床上往往多種成分同時發(fā)揮作用，僅以1、2種成分來評價往往不能反映實際的發(fā)酵效果，且各項指標的重要性也有所不同，所以需要對各個指標進行權衡考慮，設計一個綜合的評分標準進行直觀分析和方差分析，參考胡容峰等 [18]、田源紅等 [19]的方法，設計評分指標（表2）。

分數(shù)=[（指標值-指標最小值）/（指標最大值-指標最小值）]×權重。

2 結果與分析

2 1 發(fā)酵前后成分的變化

發(fā)酵過后，發(fā)酵液的顏色轉為紅紫色（圖1）。對比發(fā)酵前后的全波長掃描圖（圖2）可以看出，發(fā)酵后物質的成分有了較大的變化，特別吸收峰在約220 nm至600 nm之間物質變化較大，在 250～280 nm 和350～600 nm間吸收量上升，產生了新的吸收峰，280～350 nm間吸收量下降，說明在發(fā)酵過程中，紅曲和中藥虎杖存在著復雜的雙向作用，有些物質含量下降，被紅曲霉分解利用為自身代謝需要，有些被轉化生成新的物質或成為新的活性成分。

2 2 發(fā)酵時間對發(fā)酵結果的影響

從圖3可以看出，隨著發(fā)酵的進行，Monacolin[KG 3]K呈現(xiàn)增加的趨勢，紅曲霉生物量、游離大黃素、白藜蘆醇先增長后降低，而結合大黃素和虎杖苷呈現(xiàn)降低的趨勢，說明大黃素、白藜蘆醇的增加分別來自于結合大黃素和虎杖苷的轉化。白藜蘆醇含量的增減和紅曲霉生物量的變化呈現(xiàn)高度的一致，而大黃素的增減變化滯后于紅曲霉生物量的變化，大致在白藜蘆醇苷絕大部分降解為白藜蘆醇后才開始大幅度增加，似乎顯示紅曲霉首先分解虎杖甘，在虎杖苷分解殆盡后才分解結合大黃素，這和田天麗等的試驗結果 [20]類似，但是發(fā)酵時間延長至6 d左右，這一方面是因為為了獲得較高的莫納可林K產量，采用了變溫發(fā)酵的方法，另一方面和紅曲霉生長較為緩慢和其β葡萄糖苷酶活性較低有直接關系。在發(fā)酵的后期，雖然虎杖苷和結合大黃素的量仍在降低，但大黃素和白藜蘆醇的量不升反降，可能在發(fā)酵后期，其他營養(yǎng)物質消耗殆盡，兩者被紅曲霉利用或轉化為其他物質的結果。在發(fā)酵6 d后，白藜蘆醇的含量達到最大值，所以確定發(fā)酵的最終時間為6 d。試驗中也注意到，經(jīng)過滅菌后，大黃素的量稍有增加，而白藜蘆醇的量則稍有減少，可能和白藜蘆醇在高溫下不穩(wěn)定有關。Monacolin K總體上呈現(xiàn)增加的趨勢，發(fā)酵初期幾乎測不到Monacolin K的含量，Monacolin K的產量高峰出現(xiàn)時間延后于紅曲霉生物量的產量高峰，說明Monacolin K是紅曲霉的次生代謝產物，只有在紅曲霉菌絲量有了一定程度的增加，至平穩(wěn)期后Monacolin K才大量合成。

2 3 不同虎杖濃度對發(fā)酵結果的影響

從圖4可以看出，隨著虎杖添加量的增大，紅曲生物量、莫納可林K、白藜蘆醇和大黃素含量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，虎杖中虎杖苷、結合大黃素則呈現(xiàn)增加的趨勢。說明一定量的虎杖對于紅曲的生長和其有效活性成分Monacolin K的產生具有促進作用，而過高的添加量則會抑制紅曲霉的生長，這可能與虎杖含有多糖、黃酮類化合物、脂肪等多種有效成分，刺激了紅曲霉的代謝活動，而同時又含有多酚等抑制紅曲生長的因子有關。白藜蘆醇和大黃素在虎杖添加量為1%時低于未發(fā)酵對照組，雖然紅曲的分解會引起二者含量的增加，但是在6 d的發(fā)酵過程中，增加量在后期隨著培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的減少被紅曲霉過度分解，最終導致含量減少。在虎杖添加量為4%時，白藜蘆醇得率最大，故選擇虎杖4%作為雙向發(fā)酵的添加量。在試驗中也注意到，雖然最終添加了虎杖的發(fā)酵組紅曲霉生物量及主要活性物質莫納可林K的含量高于未加虎杖的對照組，但對照組更早地產生了菌絲球和肉眼可察覺的顏色變化，這可能由于對照組葡萄糖消耗完后又沒有補充，而紅曲色素是次級代謝產物，往往在紅曲霉即將停止生長時才大量產生，也有可能是紅曲霉對中藥虎杖的添加有一個逐漸適應的過程，具體生理過程還需要進行深入研究。

2 4 接種量對發(fā)酵結果的影響

由圖5可見，隨著紅曲霉接種量的增加，虎杖苷和結合大黃素含量降低，莫納科林K、白藜蘆醇、游離大黃素和紅曲霉生物量則先升高后降低，并不完全隨著接種量增加而增大，接種量增大，菌體代謝旺盛，分泌大量胞外酶類，有利于發(fā)酵基質的利用和菌體生長，但是接種量過大，會導致發(fā)酵液過于黏稠，影響溶氧含量，最終影響產物的合成。試驗中也注意到，不加紅曲的對照組在水溶液中浸泡后也會導致白藜蘆醇和大黃素含量的少量增加，這可能是由于水的浸泡作用，使植物組織纖維素、木質素變疏松，更有利于活性成分溶出。綜合各項因素，在接種量為6%時，各項指標均較為理想，所以確定紅曲霉6%添加量作為最終雙向發(fā)酵的接種比例。

2 5 正交試驗結果

對正交試驗結果（表3）進行方差分析可知， 僅以白藜蘆醇作為考察指標，各因素對試驗結果均有顯著（P<0 05）或極顯著（P<0 01）影響，各因素之間除了接種量2、3水平間無顯著差異外，其他各因素水平間均差異顯著，影響大小依次為接種量>發(fā)酵時間>虎杖用量，最佳發(fā)酵條件組合為A2B2C2。對于游離大黃素來說，各因素對試驗結果均有顯著影響，各因素之間除了接種量2、3水平和虎杖用量1、2水平間無顯著差異外，其他各因素水平間均差異顯著，影響大小依次為發(fā)酵時間>接種量>虎杖用量，最佳的發(fā)酵條件組合為A3B3C2。對于莫納可林K來說，各因素對試驗結果除發(fā)酵時間有顯著影響外，其他均沒有顯著影響，影響大小依次為發(fā)酵時間>接種量>虎杖用量，最佳的發(fā)酵條件組合為A2B3C2，顯示以不同的指標來考察，結果差異很大。對各項指標進行綜合考慮的結果為，各因素對實驗結果均有顯著影響，各因素之間除了接種量2、3水平之間無顯著差異外，其他各因素水平間均差異顯著，影響大小依次為接種量>虎杖用量>發(fā)酵時間，最佳的發(fā)酵條件組合為A2B3C2。即發(fā)酵時間6 d、接種量9%、虎杖用量4%，在此條件下，白藜蘆醇含量達1 29%，大黃素含量067%，莫納可林K含量0 48 mg/L。

3 結論

（1）虎杖的適量添加對于紅曲霉的生長和次級代謝產物Monacolin K的積累具有促進作用。（2）紅曲霉以虎杖作為藥性基質顯著降低了虎杖中虎杖苷和結合大黃素的含量，同時白藜蘆醇和游離大黃素的含量有了明顯的提高；（3）經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化，最佳工藝條件為：虎杖用量4%，發(fā)酵溫度 28 ℃，接種量9%，發(fā)酵6 d，發(fā)酵后虎杖中白藜蘆醇含量達1 29%，大黃素0 67%，莫納可林K含量0 48 mg/L，綜合得分為0 775；（4）紅曲和虎杖雙向發(fā)酵相互影響，有可能對現(xiàn)有成分進行了生物轉化或產生了新的活性成分，有待繼續(xù)在這一方面進行深入研究。

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