王安平　朱善元　王永娟

摘要： 以血清1型鴨甲型肝炎病毒（DHAV-1） SH株 3C 基因為序列設(shè)計1對特異性引物，RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，克隆入原核表達(dá)載體pET-32a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），在IPTG誘導(dǎo)下重組蛋白并獲得成功表達(dá)，該重組蛋白分子量約為38 ku，能與多聚組氨酸標(biāo)簽單抗發(fā)生特異性反應(yīng)。將目的蛋白切膠免疫ICR小鼠，制備重組蛋白的多抗血清，經(jīng)Western-blot分析證明，制備的抗血清能夠與DHAV-1感染的SPF雞胚尿囊液總蛋白發(fā)生特異反應(yīng)。 3C 基因在大腸桿菌中可獲得成功表達(dá)，制備的多抗血清可用于3C蛋白的檢測。

關(guān)鍵詞： 鴨甲型肝炎病毒； 3C 基因；原核表達(dá)；多抗

中圖分類號： S858 32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0205-02

鴨病毒性肝炎（DHV）是一種急性、高度致死性病毒傳染病，可引起21日齡以下的雛鴨發(fā)生急性肝炎，病死率高達(dá)100%，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的疫病之一。鴨病毒性肝炎較早認(rèn)為有3個血清型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，國內(nèi)外主要發(fā)生和流行的是Ⅰ型鴨肝炎病毒（DHV-Ⅰ） [1-2]。2005年7月，國際病毒分類委員會發(fā)表最新病毒分類第八次報告，認(rèn)為DHV-Ⅱ和DHV-Ⅲ應(yīng)歸屬于星狀病毒科；而2008年后，將引起鴨甲型病毒性肝炎的病毒歸屬于小RNA病毒科的禽肝炎病毒屬鴨甲型肝炎病毒種，并稱之為鴨甲型肝炎病毒（DHAV），包括經(jīng)典型（我國原Ⅰ型鴨肝炎病毒）、臺灣新型、韓國新型3種亞型，分別為DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3 [3-5]，其中，DHAV-1呈世界性分布，是中國DHAV流行的主要血清型。

DHAV粒子呈二十面體對稱，直徑為20～40 nm，無囊膜，核心為單股正鏈的RNA，整個基因組約有7 690個核苷酸組成，不含5′帽子結(jié)構(gòu)，3′端有poly（A）尾巴，只有1個較大的開放讀碼框，病毒RNA 指導(dǎo)合成1條完整的多聚蛋白。多聚蛋白在翻譯過程中不斷被自身編碼的蛋白酶水解，分解成VP0、VP3、VP1 3個結(jié)構(gòu)蛋白和2A1、2A2、2A3、2B、2C、3A、3B、3C、3D 9個非結(jié)構(gòu)蛋白等。3C蛋白是具有水解多聚蛋白活性的蛋白水解酶，在多聚蛋白水解、病毒復(fù)制和形成過程中發(fā)揮重要的作用 [6-7]。目前，關(guān)于DHV主要集中于基因組序列測定與分型、結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)及診斷制劑的研究，對于3C蛋白功能的研究還未見報道 [8-11]。本研究利用大腸桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)表達(dá)DHAV-1 SH株的 3C 基因，制備其多抗血清，為3C蛋白的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1 1 毒株、菌株和載體

DHAV-1 SH毒株，由中國上海獸醫(yī)研究所惠贈；10日齡SPF雞胚，購于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院國家水禽基因庫；pET-32a載體、大腸桿菌BL21（DE3）和DH5α，均為江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室保存。

1 2 酶和相關(guān)試劑

Trizol試劑盒，購自TaKaRa公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，購自Invitrogen公司；T4 DNA連接酶、BamHⅠ和SacⅠ，購于Fermentas 公司；His標(biāo)簽單抗、HRP-羊抗鼠IgG、質(zhì)粒小提試 劑盒、DAB顯色試劑盒，購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA膠回收試劑盒，購于愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司。

1 3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的DHAV-1 SH株病毒基因組序列，設(shè)計 3C 基因序列的1對引物，引物序列為：F：5′-TTAGGATCCAGCGGGCGGGTGAATTTCA-3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點）、R：5′-GACGAGCTCTTGGTTAAAAACTGGAAAA-ACC-3′（下劃線為SacⅠ酶切位點），由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1 4 DHAV-1的增殖與病毒RNA提取

取10倍稀釋的原代病毒0 2 mL接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，于37 ℃孵化箱孵化；選48～72 h死亡雞胚，4 ℃ 過夜，收集尿囊液；參照說明書按Trizol法抽提尿囊液總RNA。

1 5 DHAV-1 3C 基因的擴(kuò)增和測序

根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書操作，反應(yīng)程序：25 ℃ 10 min； 42 ℃ 90 min；70 ℃，10 min。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行0 8%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1 6 重組質(zhì)粒載體pET-3C的構(gòu)建

PCR 產(chǎn)物經(jīng)0 8%瓊脂糖凝膠電泳分離回收純化，經(jīng)BamHⅠ、SacⅠ酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET-32a連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含100 μg/mL 氨芐青霉素（Amp）的LB瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，提取質(zhì)粒電泳篩選，進(jìn)行酶切鑒定，并送由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測序，正確的克隆命名為pET-3C。

1 7 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-3C轉(zhuǎn)化至BL21（DE3），挑取單菌落接種于5 mL含Amp抗性的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)過夜；按 1% 接種量轉(zhuǎn)接至含Amp的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)，菌液D600 nm值達(dá) 0 4～1 0時，加入0 2～1 0 mmol/L IPTG，37 ℃誘導(dǎo)3～5 h；離心收集菌體，溶于適量PBS中，超聲波裂解菌體，離心后分別收集上清及沉淀， -20 ℃ 保存?zhèn)溆?。相同條件下誘導(dǎo)含表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a 的空載體及未加誘導(dǎo)劑的受體菌作為空白和陰性對照。

1 8 表達(dá)產(chǎn)物的檢測

取200 μL經(jīng)誘導(dǎo)的菌液，與50 μL 5×SDS上樣緩沖液混勻，沸水煮沸3 min，SDS-PAGE凝膠電泳分析。將誘導(dǎo)樣品和非誘導(dǎo)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，以鼠抗His單抗作為一抗，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠為二抗，DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

1 9 重組蛋白抗血清的制備

將重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，切出回收目的條帶，加入少量PBS研磨勻漿化；皮下兩點注射法免疫6周齡ICR小鼠，每隔2周免疫1次；4次免疫后第14天采血，分離血清，-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1 10 多抗血清的Western blot 鑒定

將DHAV-Ⅰ SH毒株雞胚尿囊液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，以制備的鼠多抗血清作為一抗，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠為二抗，DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。以未接種DHAV-1的雞胚尿囊液作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2 1 3C 基因的克隆

以提取的尿囊液總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增出約 550 bp 的目的條帶。經(jīng)BamHⅠ、SacⅠ雙酶切獲得約550、5 900 bp 2個條帶（圖1）；經(jīng)進(jìn)一步測序，克隆的 3C 基因序列及閱讀框完全正確。

2 2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測

由圖2可見，IPTG濃度為1 0 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)4～5 h，重組蛋白可得到較高水平表達(dá)，并都以包涵體形式存在，重組蛋白相對分子量約為38 ku。由圖3可見，以抗His標(biāo)簽單抗對重組蛋白進(jìn)行鑒定，在目的位置出現(xiàn)1條特異條帶。

2 3 多抗血清的Western blot 鑒定

結(jié)果表明，獲得的3C蛋白多抗血清不僅能與pET-3C重組菌誘導(dǎo)，發(fā)生重組蛋白反應(yīng)，而且能與DHAV-Ⅰ SH毒株雞胚尿囊液反應(yīng)，形成3C蛋白大小約為20 ku的條帶（圖4）。

3 討論

鴨甲型肝炎病毒歸屬于小RNA 病毒科的禽肝炎病毒屬鴨甲型肝炎病毒種，與其他小核糖核酸病毒一樣，病毒基因組只編碼一個大的開放閱讀框，翻譯形成一多聚蛋白，需進(jìn)一步剪切加工形成結(jié)構(gòu)蛋白及病毒復(fù)制必須的功能蛋白。在鴨肝炎病毒蛋白加工過程中，3C蛋白是唯一起蛋白酶作用的蛋白，它可以將多聚蛋白加工成單個具有獨立功能的病毒蛋白，在病毒復(fù)制及衣殼裝配過程中起重要作用。

pET表達(dá)系統(tǒng)是目前使用較為廣泛的一種原核表達(dá)系統(tǒng)，在誘導(dǎo)狀態(tài)下，外源基因可以獲得高效表達(dá)，表達(dá)量一般可以達(dá)到菌體總蛋白的30%以上。表達(dá)的融合蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽，方便目的蛋白的純化，其腸激酶酶切位點可切除融合部分，有利于對目的蛋白的研究。本試驗用pET-32a表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了DHAV-1 3C蛋白，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出完整的 3C 基因，經(jīng)分析該基因長為543 bp，與DHAV-1 SH株序列同源性達(dá)100%，SDS-PAGE電泳證明表達(dá)的融合蛋白分子量約為38 ku。

盡管pET原核系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白缺少翻譯加工功能，但表達(dá)產(chǎn)物依舊保持了良好的免疫原性。本試驗利用表達(dá)的融合蛋白免 疫小鼠制備了針對重組蛋白的多抗血清，Western- blot分析說明制備的多抗血清可與DHAV-1尿囊液中的3C

蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，制備的多抗血清具有很好的特異性，可作為檢測用抗體進(jìn)一步用于DHAV-1 3C抗原的檢測及功能研究。

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