李琰　詹曉平　楊靜等

摘要：PIN2蛋白作為生長(zhǎng)素外排蛋白，在植物根的向地性生長(zhǎng)中起重要作用。免疫定位法是一種可以將蛋白在植物細(xì)胞中快速準(zhǔn)確定位的方法。本研究利用改良的免疫熒光定位法，對(duì)PIN2蛋白在水稻根尖細(xì)胞中的定位進(jìn)行了觀察，并與前人的兩種方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，與已有的方案比較，改良免疫熒光定位法可使PIN2蛋白在水稻根尖細(xì)胞中的位置快速準(zhǔn)確地被觀察到，且簡(jiǎn)化了操作步驟，操作方便快速，可廣泛應(yīng)用于植物其他蛋白的定位研究。

關(guān)鍵詞：PIN2蛋白；免疫熒光定位；水稻；根尖細(xì)胞

中圖分類(lèi)號(hào)：S511+S188+.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）08-0104-03

Abstract PIN2 as an auxin efflux protein plays important roles in geotropic growth of plant roots. Immunolocalization technique is a method which allows rapid and reliable in situ localization of proteins in plant cells. In this paper， the improved immunolocalization technique was used to localize the PIN2 in root tip cells of rice， and its effect was compared to the two existing methods. The results showed that the location of PIN2 could be more quickly and accurately determined in root tip cells of rice by the improved method； and the improved method simplified the operation procedures and was more convenient， so it could be used for the localization researches of other plant proteins in the future.

Key words PIN2 protein； Immunolocalization； Rice； Cells of root tips

PIN蛋白家族定位于細(xì)胞膜，而這種極性定位決定了生長(zhǎng)素的極性流向及梯度分布[1～3]，植物通過(guò)維持PIN蛋白在內(nèi)吞循環(huán)途徑及液泡降解與儲(chǔ)存途徑間的動(dòng)態(tài)平衡，控制生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸效率[4，5]。生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸在植物胚胎、側(cè)生器官的發(fā)生與發(fā)育、向性生長(zhǎng)中起了關(guān)鍵性的調(diào)控作用，已成為植物發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一[6]。PIN2蛋白屬于生長(zhǎng)素的外排蛋白，在植物根尖表皮層及真皮層細(xì)胞中表達(dá)，主要在植物根向地性生長(zhǎng)中起作用[7]。植物根系的向地性決定著根系空間生長(zhǎng)的趨勢(shì)，對(duì)植物養(yǎng)分的吸收 （特別是磷的吸收）具有著重要的影響[8]。因此，深入研究植物根系向地性的分子機(jī)制及PIN2蛋白在植物根系中的定位對(duì)于植物根系遺傳改良具有實(shí)踐和理論的指導(dǎo)意義。

蛋白質(zhì)的功能、相互聯(lián)系或活性的研究需要一種在細(xì)胞及亞細(xì)胞水平對(duì)蛋白定位的可靠分析方法。Brandizzi等[9]采用DNA與熒光蛋白重組技術(shù)研究了活體內(nèi)蛋白的亞細(xì)胞定位，其缺點(diǎn)為重組的蛋白質(zhì)分子特性已改變，可能不會(huì)精確定位，基于蛋白抗體的免疫定位則克服了這一缺陷。Lauber[10]和Friml等[11]提出了適于小段組織蛋白免疫定位的方案；Sauer等[12]在他們的方法上進(jìn)行了改進(jìn)，使其更加省時(shí)、簡(jiǎn)便、可自動(dòng)化。目前，免疫定位技術(shù)被廣泛應(yīng)用于擬南芥、煙草、馬鈴薯等植物的研究中，而水稻根尖組織中蛋白的免疫定位尚未見(jiàn)報(bào)道。由于水稻細(xì)胞壁擁有“角質(zhì)-雙硅層”結(jié)構(gòu)，降低了細(xì)胞的相對(duì)透性[13]，對(duì)蛋白免疫定位有較大的干擾。本研究在Friml和Michael的方法上進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)試劑、承載體及操作步驟進(jìn)行了優(yōu)化，采用改進(jìn)的免疫熒光方法，以水稻根尖組織作為供試材料，觀察了PIN2蛋白的定位，并與Friml和Sauer的方法進(jìn)行分析比較，力求尋找一種簡(jiǎn)便快速、可用于水稻根尖細(xì)胞中蛋白精確定位的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為野生型水稻LTH，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器及試劑

儀器：96孔板，載玻片，真空泵，激光共聚焦顯微鏡（Leica confocal microscope SP5）。

試劑：磷酸鹽緩沖液（PBS），pH 8.06；一抗PIN2-驢抗羊IgG；二抗驢抗雞IgG。

1.3 試驗(yàn)方法

分別對(duì)改良的免疫熒光定位法、Friml和Sauer的蛋白定位方法進(jìn)行分析比較，具體方法如下。

1.3.1 改良免疫熒光定位法 ①取水稻苗期1 cm根尖組織，置于96孔板內(nèi)。②向裝有根尖組織的孔內(nèi)加入適量4%多聚甲醛固定液，于真空狀態(tài)下室溫固定1 h；用PBS+0.5% Triton X-100吹洗5次，再用雙蒸水吹洗2次，每次吹洗均為10 min；最后將根尖組織浸泡于雙蒸水，37℃放置12 min。③用崩潰酶于37℃處理1 h，PBS+0.5% Triton X-100吹洗5次，每次12 min；加適量滲透液（含10% DMSO和2% Nonidet-P40），室溫處理1.5 h，PBS吹洗6次，每次10 min。④加適量2% BSA，于37℃封閉1 h；加入一抗，于4℃放置過(guò)夜；用PBS+0.3% Triton X-100吹洗5次，每次12 min。⑤加入二抗，于37℃放置3 h；用PBS+0.5% Triton X-100吹洗5次，每次12 min。⑥在載玻片上滴一滴抗熒光猝滅封片液，將處理的根尖組織放入其中，壓片后用激光共聚焦顯微鏡觀察。endprint

1.3.2 Friml的方法 ①取水稻苗期1 cm根尖組織。②使用4%多聚甲醛固定液，于真空狀態(tài)下室溫固定1 h；用PBS和ddH2O分別吹洗2次，每次10 min；將根尖組織置于載玻片上，液氮冷凍干燥后浸泡于PBS中10 min。③用崩潰酶于37℃處理40 min，PBS吹洗4次，每次5 min；加適量滲透液（含10% DMSO和1% Nonidet-P40），室溫處理1 h，用PBS吹洗6次，每次5 min。④加適量2% BSA，于37℃封閉2 h；加入一抗，于4℃放置過(guò)夜；用PBS吹洗6次，每次5 min。⑤加入二抗，于37℃放置3 h；用PBS和ddH2O分別吹洗2次，每次5 min。⑥在載玻片上滴一滴抗熒光猝滅封片液，將處理的根尖組織放入其中，壓片后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.3 Sauer的方法 ①取水稻苗期1 cm根尖組織置于微量離心管中。②加入固定液（含4%多聚甲醛，1×PBS和0.1% Triton X-100），于真空狀態(tài)下室溫固定1 h；用PBS和ddH2O分別吹洗2次，每次10 min；將根尖組織置于顯微鏡載玻片上，加一滴水，室溫過(guò)夜干燥。③用PBS浸泡5 min，2%崩潰酶于37℃處理1 h，再用PBS吹洗6次，每次5 min；加適量滲透液（含10% DMSO和3% IGEPAL CA-630），室溫處理1 h， PBS吹洗6次，每次5 min。④加適量3% BSA，于室溫封閉1 h；加入一抗，于4℃放置過(guò)夜；用PBS吹洗6次，每次10 min。⑤加入二抗，于37℃放置3 h；用PBS吹洗6次，每次10 min。⑥在載玻片上滴一滴抗熒光猝滅封片液，將處理的根尖組織放入其中，壓片后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻根尖組織染色結(jié)果

在激光共聚焦顯微鏡下觀察，看到Friml和Sauer方法的部分水稻根尖組織染色效果較混亂，不易于觀察目的蛋白的精確定位；而改進(jìn)的免疫熒光定位法，大部分水稻根尖組織染色效果較清晰，目的蛋白可以較精確定位（圖1）?？梢?jiàn)，改良免疫熒光定位法對(duì)水稻根尖組織PIN2蛋白的定位效果要好于Friml和Sauer方法。

2.2 免疫熒光標(biāo)記蛋白結(jié)果

觀察實(shí)驗(yàn)中根尖分生區(qū)與伸長(zhǎng)區(qū)的細(xì)胞染色結(jié)果（圖2），看到細(xì)胞膜均被染色，且染色效果較清晰；PIN2蛋白主要分布于細(xì)胞膜，這與染色結(jié)果相符合，但是細(xì)胞表面有多余非特異信號(hào)。

3 討論

本試驗(yàn)主要從以下幾點(diǎn)對(duì)Friml和Sauer的方法進(jìn)行了優(yōu)化：①引入了96孔板，使操作均在96孔板中進(jìn)行；②調(diào)整了處理及吹洗時(shí)間；③調(diào)整了試劑濃度；④多次使用Triton X-100對(duì)根尖組織進(jìn)行處理；⑤簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟。改良之后的方法縮短了整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，96孔板的使用可以使多個(gè)平行實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行，吹洗更加徹底，實(shí)驗(yàn)操作方便快捷，處理效果得到優(yōu)化。

本研究對(duì)水稻根尖細(xì)胞中蛋白定位的三種方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)方案使水稻根尖細(xì)胞中目的蛋白PIN2的定位清晰可見(jiàn)，并且實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)化，操作方便快速，提高了實(shí)驗(yàn)效率。PIN2作為生長(zhǎng)素的外排蛋白，其研究對(duì)于探究根發(fā)育的分子機(jī)制及推進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育的優(yōu)化改良有重大意義，同時(shí)，為其它參與內(nèi)吞作用的蛋白的定位提供了較好的方法，有助于深入研究?jī)?nèi)吞作用的機(jī)制。

由于操作步驟簡(jiǎn)化，改良的免疫熒光定位法存在一定的缺陷，如仍存在有多余非特異信號(hào)等，分析其原因可能是與相應(yīng)抗原發(fā)生了交叉反應(yīng)，因此本方案仍需要進(jìn)一步的改進(jìn)研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

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