羅飛，翁西倫，鮑宗必，楊亦文，任其龍

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，生物質(zhì)化工教育部重點實驗室，浙江 杭州 310027）

高穩(wěn)定性硅基雜化纖維素衍生物手性固定相的制備及其色譜拆分性能

羅飛，翁西倫，鮑宗必，楊亦文，任其龍

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，生物質(zhì)化工教育部重點實驗室，浙江 杭州 310027）

合成了含少量3-（三乙氧基硅）丙基氨基甲酸酯的纖維素3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯衍生物（CDMPC），并采用1,2-二(三乙氧基硅基)乙烷（BTSE）為偶聯(lián)劑，通過溶膠-凝膠法成功制備得到新型硅基雜化手性固定相。該固定相的CDMPC含量達(dá)60%，在含有10%氯仿的流動相中保持良好的手性識別性能和機(jī)械強(qiáng)度。使用其拆分了多種手性化合物，拆分效果優(yōu)于商品柱Chiralpak IB，其中對2,2,2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇和反式二苯乙烯氧化物對映體的分離選擇性分別達(dá)到2.99和2.48，表明該類硅基雜化類手性固定相在制備色譜領(lǐng)域中有潛在應(yīng)用前景。

手性固定相；雜化材料；色譜；分離；機(jī)械性能；溶劑耐受性

引　言

手性化合物的研發(fā)，是生物醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品添加劑和功能性材料等領(lǐng)域的研究熱點[1-3]。目前色譜法是獲取單一對映體的主要方法之一[4-9]，其技術(shù)的關(guān)鍵是手性固定相（chiral stationary phases，CSPs）的制備。在現(xiàn)有CSPs中[10-15]，纖維素衍生物類CSPs憑借上載量大、手性識別范圍廣等優(yōu)點在色譜中廣為應(yīng)用[16-21]。但是，目前市售商品柱（如Chiralcel OD和Chiralpak IB）一般通過涂覆或鍵合手段得到，纖維素含量較低[＜20%（質(zhì)量）]，上載量有限，在制備色譜領(lǐng)域的應(yīng)用具有局限性。2008 年Okamoto等[22]報道了采用少量3-（三乙氧基硅）丙基氨基甲酸酯的纖維素3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯衍生物作為手性識別體，使用溶膠-凝膠反應(yīng)交聯(lián)正硅酸乙酯[TEOS，Si(OC2H5)4]制備得到有機(jī)無機(jī)雜化的硅球，纖維素衍生物含量高達(dá)70%，具備遠(yuǎn)高于商品柱的載量。然而，此類CSP（稱為CSP-T）因其有機(jī)含量（CDMPC）過高而容易在氯仿等溶劑中溶脹以及在堿性溶劑中堿解[22-23]，限制了其適用的流動相范圍； TEOS交聯(lián)劑分子剛性大，溶脹過程易使硅球破裂，導(dǎo)致使用過程中柱壓不斷上升。這些不足極大地限制了其在制備色譜中的應(yīng)用。

為提高CSP-T對氯仿的耐受性，本課題組曾通過增加CDMPC衍生的3-（三乙氧基硅）丙基異氰酸酯比例，并調(diào)控溶膠-凝膠過程的 pH，將無機(jī)比例升到50%（質(zhì)量），提高了CSP-T的穩(wěn)定性[23-24]。然而，由于過多引入了3-（三乙氧基硅）丙基異氰酸酯，破壞了 CDMPC的高度螺旋結(jié)構(gòu)，降低了CSP-T的拆分性能。相較于 TEOS，1,2-二(三乙氧基硅基)乙烷[BTSE，(C2H5OSi)3CH2CH2(SiOC2H5)3]的分子尺寸更大，有更好的抗溶脹性能，可在不破壞CDMPC分子結(jié)構(gòu)下與其進(jìn)行交聯(lián)雜化，從而確保其手性拆分性能和機(jī)械強(qiáng)度。

本文使用 3,5-二甲基苯基異氰酸酯和少量 3-（三乙氧基硅）丙基異氰酸酯對纖維素進(jìn)行衍生化制得含硅酸酯結(jié)構(gòu)的CDMPC，使其具備與BTSE交聯(lián)的活性結(jié)構(gòu)，采用溶膠-凝膠法將 BTSE和CDMPC成功交聯(lián)獲得雜化手性硅球（此類CSP稱為 CSP-B），并詳細(xì)考察其手性拆分性能、機(jī)械強(qiáng)度、抗溶劑穩(wěn)定性等性質(zhì)。

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

微晶纖維素購自上海昌為醫(yī)藥輔料公司，3,5-二甲基苯基異氰酸酯和反式二苯乙烯氧化物購自Sigma公司，3-（三乙氧基硅）丙基異氰酸酯、三甲基氯硅烷、安息香和乙酰丙酮鈷（Ⅲ）購自阿拉丁公司，BTSE購自 Gelest公司，2,2,2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇、黃烷酮購自TCI公司，2-苯基環(huán)己酮購自天津希恩恩生化公司。

所用儀器包括：RCT basic control攪拌器（IKA公司），DZF型真空干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），ME204E型天平（梅特勒-托利多公司），Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀（賽默飛世爾公司），Pyris 1 TGA（Perkin-Elmer公司），vario micro元素分析儀（ELEMENTAR公司），球差校正場發(fā)射掃描透射電鏡 Titan G2 80-200 ChemiSTEM（SEM）（FEI公司）。

1.2實驗過程

1.2.1CDMPC的制備首先，將1 g纖維素與40 ml N,N-二甲基乙酰胺置于三口燒瓶中，于150℃下回流1 h后降溫至100℃，再加入4 g氯化鋰；降溫至50℃，待纖維素全部溶解時，加入25 ml吡啶和2.1 g 3,5-二甲基苯基異氰酸酯[纖維素羥基的 77% （mol）]，80℃下攪拌8 h。隨后加入0.13 g 3-（三乙氧基硅）丙基異氰酸酯[纖維素羥基的3%（mol）]，在80℃下攪拌12 h。最后，殘留的羥基用過量的3,5-二甲基苯基異氰酸酯[纖維素羥基的117%（mol），3.2 g]處理，在80℃下反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后用無水甲醇使產(chǎn)物沉淀，抽濾洗滌并干燥。

1.2.2有機(jī)-無機(jī)雜化硅球的制備稱取 0.25 g CDMPC，溶于24 ml四氫呋喃中，再加入6 ml正庚醇，0.9 ml BTSE，1 ml水和0.5 ml三甲基氯硅烷，于80℃下反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后將其加入到80℃的十二烷基硫酸鈉水溶液中（500 ml水，濃度為0.2%）以1100 r·min-1速度攪拌陳化1 h。然后將產(chǎn)物抽濾，依次用熱水、乙醇和正己烷洗滌并干燥。

1.2.3硅球封端和色譜柱填裝取1 g硅球，加入5 ml三甲基氯硅烷和 20 ml無水甲苯，氮氣氛下于80℃反應(yīng)8 h。抽濾分離出產(chǎn)物，用無水甲醇洗滌。以正己烷/異丙醇溶液（90:10，體積比）為勻漿劑和頂替液，40 MPa壓力下將其填裝入空色譜柱內(nèi)（150 mm×4.6 mm I. D.），并標(biāo)記流動相流動方向。

1.2.4CSP色譜拆分性能測試色譜拆分實驗在30℃下進(jìn)行，檢測波長為 254 nm，流速為 1 ml·min-1，以1,3,5-三叔丁基苯為無保留物質(zhì)測定死時間。6種光學(xué)對映體底物的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1　本文拆分的6種對映體結(jié)構(gòu)式Fig.1　Structures of investigated racemates

2　結(jié)果與討論

2.1CDMPC和CSP-B的表征

2.1.1CDMPC結(jié)構(gòu)的表征用FT-IR測定纖維素和CDMPC的紅外吸收光譜（圖2）。由圖可知，相較于纖維素，CDMPC在3000～3750 cm-1處的吸收峰明顯減弱，說明纖維素上的大部分羥基已被異氰酸酯所酯化；同時，相同波數(shù)處的吸收峰極有可能為兩種異氰酸酯上的-NH-基團(tuán)。另外，CDMPC 在1740 cm-1波數(shù)左右出現(xiàn)了新的吸收峰，為異氰酸酯上的伸縮振動，上述吸收峰的變化說明纖維素羥基已被成功衍生化。

圖2　纖維素和CDMPC的紅外吸收譜圖Fig.2　FT-IR spectra of cellulose and CDMPC

CDMPC的元素分析結(jié)果表明，其 C含量為63.71%，N含量為6.74%，H含量為6.38%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。由此計算出纖維素上羥基的取代率為98.9%，可見大部分羥基已經(jīng)酯化。此外，對CDMPC進(jìn)行1H NMR分析（圖3），由基團(tuán)Ph/SiCH2氫吸收峰的峰面積比例可以確定兩種異氰酸酯的取代比例為98.6:1.4。

圖3　CDMPC的氫核磁共振譜圖Fig.3　1H NMR spectra of CDMPC

2.1.2CSP-B的結(jié)構(gòu)及形貌表征對CSP-B也進(jìn)行了FT-IR表征（圖2），幾乎與CDMPC的譜圖一致，可見在交聯(lián)雜化過程中保留了CDMPC的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖4為CSP-B微球的SEM圖，可以看出，所得硅球為完整且圓滑的球形形貌。

圖4　CSP-B的電鏡掃描圖Fig.4　SEM images of CSP-B

對 CSP-B進(jìn)行熱重分析，得到其有機(jī)-無機(jī)比為60:40（圖5），即殘余物SiO2作為骨架的質(zhì)量占40%，而實驗發(fā)現(xiàn)[23]，該比例下難以獲得良好球形度的 CSP-T。這可能是因為 BTSE分子結(jié)構(gòu)相對TEOS更疏水，在熱水環(huán)境中陳化時，更易與CDMPC等疏水高分子交聯(lián)縮聚而成球。

圖5　CDMPC和CSP-B的熱重分析圖Fig.5　Thermogravimetric analysis of CDMPC and CSP-B

2.2CSP-B使用性能評價

2.2.1手性識別性能的考察本文以正己烷/異丙醇為流動相，分別對圖1所示的6種外消旋體進(jìn)行色譜拆分，結(jié)果列于表1。主要選取容量因子k1和選擇性系數(shù)α兩個參數(shù)與CSP-T及商品柱進(jìn)行對比并評價CSP-B。其中容量因子k1=(t1-t0)/t0，k2=(t2-t0)/t0，反映與固定相的作用強(qiáng)弱；選擇性系數(shù)α=k2/k1，表示手性固定相的手性識別能力，其中 t0、t1、t2分別為死時間、兩對映體先后出峰時間。

表1　正己烷/異丙醇流動相中底物的拆分情況Table 1　Resolution of racemates using n-hexane/2-propanol

由表1可知，隨著流動相中異丙醇含量的增加，大體上各對映體的保留因子k1變小，選擇性系數(shù)α也降低，因為異丙醇作為質(zhì)子型溶劑，易與手性固定相上的氨基甲酸酯基團(tuán)形成氫鍵。因此，異丙醇濃度越高，流動相極性越強(qiáng)，對映體和手性固定相之間的作用變?nèi)?，保留時間變短，此規(guī)律與文獻(xiàn)報道[25]一致。

本文還采用不同比例的正己烷/乙醇為流動相拆分這6種對映體，以及25°C下CSP-B的拆分結(jié)果分別見表2和表3。

表2　正己烷/乙醇流動相中底物的拆分情況Table 2　Resolution of racemates using n-hexane/ethanol

表3　25℃時底物的拆分情況Table 3　Resolution of racemates at 25℃

由表1可知，與CSP-T相比，CSP-B在分離對映體1，2和3時，取得了更佳的效果，尤其是對映體1和2，α均大于2，并達(dá)到基線分離（圖6），說明CSP-B達(dá)到了與CSP-T相當(dāng)甚至更高的手性拆分性能。而與商品柱IB柱對比，CSP-B在分離對映體1，2，3和5時，取得了更佳的效果，說明采用從頭合成的方式不會過多地破壞纖維素衍生物的手性識別能力。

在理論塔板數(shù)方面，本文制備的CSP-B由于微球粒徑較不均一，平均粒徑較商品柱大得多，理論塔板數(shù)約 100，與商品柱仍有較大差距，制備粒徑可控的手性固定相也是今后工作值得探索的研究方向。

2.2.2CSP-B使用穩(wěn)定性的考察由于雜化硅球是微米級材料，直接對其單個顆粒進(jìn)行機(jī)械強(qiáng)度評價有一定難度，因此本文通過考察流速和柱壓降的關(guān)系曲線來判斷色譜柱整體的機(jī)械強(qiáng)度。

圖6　底物1和2的拆分色譜圖Fig.6　Chromatograms for resolution of racemate 1 and 2 on CSP-B

圖7　柱壓和流速之間的關(guān)系Fig.7　Relationships between volumetric flow rate and pressure drop across column (1 psi=6894.76 Pa)

圖7是CSP-B在流動相分別為正己烷/異丙醇[90:10，（a）]、正己烷/氯仿/異丙醇[80:10:10，（b）]、正己烷/異丙醇/三氟乙酸[90:10:0.1，（c）]和正己烷/異丙醇/二乙胺[90:10:0.5，（d）]中測得的柱壓隨流速變化的曲線。通常，當(dāng)硅球達(dá)到耐壓極限后，若流速進(jìn)一步上升，過高柱壓致使硅球被壓縮而觀察到柱壓驟升，由此可判斷最大承受的柱壓。由圖 7可見，在流速達(dá)到 3 ml·min-1的情況下，CSP-B的柱壓和流速之間依然呈良好的線性關(guān)系，證明了其仍具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，其最大壓降超過 2000 psi（1 psi=6894.76 Pa），遠(yuǎn)高于涂覆型商品柱OD柱僅為700 psi的耐壓上限。

為了進(jìn)一步探究CSP-B的抗溶脹性能，本文將其在正己烷/氯仿/異丙醇（80:10:10）流動相下以1ml·min-1的流速運(yùn)行了 19 h，柱壓始終保持恒定[圖7（b）]。之后又在此條件下分離了上述6種對映體，取得了預(yù)期的分離效果（表1），進(jìn)一步證明了氯仿的存在不會對手性識別劑的結(jié)構(gòu)造成破壞，從而影響CSP-B的手性拆分性能。除此之外，本文還在流動相中添加 0.1%的三氟乙酸[圖 7（c）]或0.5%的二乙胺[圖7（d）]，柱壓仍穩(wěn)定維持在某一壓力值。當(dāng)切換回正己烷/異丙醇流動相時，CSP-B 對6種底物拆分的保留因子和手性選擇性均幾乎不變，展現(xiàn)了良好的耐溶劑性能和穩(wěn)定的手性識別性能。

3　結(jié)　論

本文采用BTSE作為硅烷偶聯(lián)劑制備得到新的硅基雜化纖維素類手性固定相CSP-B，通過紅外、電鏡、元素分析、核磁和熱重等表征手段確認(rèn)了其形貌和有機(jī)無機(jī)比例，考察其在不同流動相中的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械性能，并對其色譜拆分性能進(jìn)行了探究。研究結(jié)果表明，CSP-B不僅具有超過商品柱Chiralpak IB的優(yōu)良的手性拆分性能，而且具有理想的機(jī)械強(qiáng)度和抗溶脹能力，可在堿性、酸性以及含氯仿的流動相中保持穩(wěn)定的手性識別性能，證明其在模擬移動床等制備色譜領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用前景。

References

[1]Ikai T, Okamoto Y. Structure control of polysaccharide derivatives for efficient separation of enantiomers by chromatography [J]. Chemical Reviews, 2009, 109 (11): 6077-6101.

[2]Lorenz H, Seidel Morgenstern A. Processes to separate enantiomers [J]. Angewandte Chemie International Edition, 2014, 53 (5): 1218-1250.

[3]He Yongzhu (何永祝), Pang Hao (龐浩), Liao Bing (廖兵). Progress in cellulose-based chiral stationary phases [J]. Progress in Chemistry(化學(xué)進(jìn)展), 2006, 18: 957-965.

[4]Zhang Guojun (張國俊), Ruan Zhengang (阮振剛), Gao Xue (高學(xué)), Ji Shulan (紀(jì)樹蘭), Liu Zhongzhou (劉忠洲). Chiral separation with affinity membrane technology and chiral selective solid membrane [J]. Chemical Industry and Engineering Progress (化工進(jìn)展), 2008, 27 (6): 797-803.

[5]Cavazzini A, Pasti L, Massi A, Marchetti N, Dondi F. Recent applications in chiral high performance liquid chromatography: a review [J]. Analytica Chimica Acta, 2011, 706 (2): 205-222.

[6]Huang Bei (黃蓓), Yang Lirong (楊立榮), Wu Jianping (吳堅平). Chiral resolution techniques in industrial practice [J]. Chemical Industry and Engineering Progress (化工進(jìn)展), 2002, 21 (6): 375-380.

[7]Zheng Xi (鄭熙), Hu Xiaoling (胡小玲). Development of membranes for chiral resolution [J]. Chemical Industry and Engineering Progress(化工進(jìn)展), 2008, 27 (11): 1703-1709.

[8]Qi Xuan (亓?xí)t), Luo Guangsheng (駱廣生). Advances on enantioseparation of amino acid by solid membrane [J]. Chemical Industry and Engineering Progress (化工進(jìn)展), 2004, 23 (9): 963-967.

[9]Schiel J E, Mallik R, Soman S, Joseph K S, Hage D S. Applications of silica supports in affinity chromatography [J]. Journal of Separation Science, 2006, 29 (6): 719-737.

[10]Stringham R. The use of polysaccharide phases in the separation of enantiomers[C]. 2006: 257-290.

[11]Subramani-An G. Chiral Separation Techniques: A Practical Approach[M]. 3rd ed. Weinheim: Wiley-VCH, 2007.

[12]Wei Feng (危鳳), Shen Bo (沈波), Chen Mingjie (陳明杰), Zhou Xianbo (周先波), Wu Pingdong (吳平東). Omeprazole resolution by simulated moving bed chromatography [J]. Journal of Chemical Industry and Engineering (China) (化工學(xué)報), 2005, 56 (9): 1699-1702.

[13]Li Xiaogang, Liu Yiping, Hu Changdi, Bai Lianyang, Gao Bida, Huang Kelong. Direct optical resolution of chiral pesticides by high performance liquid chromatography [J]. Chinese Journal of Chemical Engineering, 2011, 19 (4): 603-609.

[14]Qi Yuan (祁媛). Synthesis and application of the composite chitosan of chiral stationary phase [D]. Lanzhou: Lanzhou Jiaotong University, 2013.

[15]Lei Ming (雷鳴). Preparation of chiral stationary phase based on amino acid ligand [D]. Wuxi: Jiangnan University, 2012.

[16]Yashima E, Okamoto Y. Chiral discrimination on polysaccharides derivatives [J]. Bulletin of the Chemical Society of Japan, 1995, 68 (12): 3289-3307.

[17]Yashima E, Yamamoto C, Okamoto Y. Polysaccharide-based chiral LC columns [J]. Synlett., 1998, (4): 344-360.

[18]Yashima E. Polysaccharide-based chiral stationary phases for high performance liquid chromatographic enantioseparation [J]. Journal of Chromatography A, 2001, 906 (1): 105-125.

[19]Schulte M, Ditz R, Devant R M, Kinkel J N, Charton F. Comparison of the specific productivity of different chiral stationary phases used for simulated moving-bed chromatography [J]. Journal of Chromatography A, 1997, 769 (1): 93-100.

[20]Francotte E R. Enantioselective chromatography as a powerful alternative for the preparation of drug enantiomers [J]. Journal of Chromatography A, 2001, 906 (1): 379-397.

[21]Weng Xilun (翁西倫), Bao Zongbi (鮑宗必), Luo Fei (羅飛), Su Baogen (蘇寶根), Yang Yiwen (楊亦文), Ren Qilong (任其龍). Progress in preparation and applications of cellulose derivatives based chiral stationary phase [J]. Progress in Chemistry (化學(xué)進(jìn)展), 2014, 26 (2/3): 415-423

[22]Ikai T, Yamamoto C, Kamigaito M, Okamoto Y. Organic-inorganic hybrid materials for efficient enantioseparation using cellulose 3,5-dimethylphenyl carbamate and tetraethyl orthosilicate [J]. Chemistry-An Asian Journal, 2008, 3 (8/9): 1494-1499.

[23]Weng X, Bao Z, Xing H, Zhang Z, Yang Q, Su B, Yang Y, Ren Q. Synthesis and characterization of cellulose 3, 5-dimethylphenylcarbamate silica hybrid spheres for enantioseparation of chiral β-blockers [J]. Journal of Chromatography A, 2013, 1321: 38-47.

[24]Weng X, Bao Z, Zhang Z, Su B, Xing H, Yang Q, Yang Y, Ren Q. Preparation of porous cellulose 3, 5-dimethylphenyl carbamate hybrid organosilica particles for chromatographic applications [J]. Journal of Materials Chemistry B, 2015, 3 (4): 620-628.

[25]Jin Zhaolei (金召磊), Hu Fangfang (胡芳芳), Wang Yibo (汪一波)，Liu Guihua (劉貴花), Wang Fang (王芳), Pan Fuyou (潘富友), Tang Shouwan (唐守萬). Preparation and evaluation of amylose and cellulose tris(3-trifluoromethylphenylcarbamates)-based chiral stationary phases [J]. Journal of Chromato (色譜), 2011, 29: 1087-1092.

Preparation and characterization of highly stable hybrid organosilica cellulose derivative-based chiral stationary phase

LUO Fei, WENG Xilun, BAO Zongbi, YANG Yiwen, REN Qilong
(Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang, China)

Chiral chromatography plays an important role in obtaining optically pure enantiomers. The key to preparative chiral chromatography is the availability of chiral stationary phases (CSPs) with broad chiral recognition, high sample loading as well as solvent tolerance. In order to overcome the shortcoming of traditional coating-type or bonding-type cellulose-based CSPs, a novel hybrid CSP based on cellulose derivative bearing a small amount of 3-(triethoxysilyl)propyl groups was proposed, which was used to crosslink with bis(triethoxysilyl)ethane (BTSE) via a sol-gel reaction. The prepared stationary phase was then evaluated by HPLC. The experimental results indicated that the CSP showed excellent chiral recognition ability and could run steadily at back column pressure more than 2000 psi (1 psi=6894.76 Pa) with flow-rate up to 3 ml·min-1in the mobile phase containing 10% chloroform. It was worth mentioning that the selectivity of 2,2,2-trifluoro-1-(9-anthryl)ethanol and trans-stilbene oxide up to 2.99 and 2.48 was achieved, respectively, confirming its excellent chiral recognition performance. In addition, the reported CSP showed a promising packing for application in preparative chromatography such as simulated moving bed chromatography.

chiral stationary phase; hybrid material; chromatography; separation; mechanical properties; solvent stability

date: 2015-05-04.

Prof. BAO Zongbi, baozb@zju.edu.cn

supported by the National Natural Science Foundation of China (21006083, 21376205) and the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY13B060002).

10.11949/j.issn.0438-1157.20150547

O 657.7

A

0438—1157（2015）11—4520—06

2015-05-04收到初稿，2015-06-23收到修改稿。

聯(lián)系人：鮑宗必。第一作者：羅飛（1990—），男，碩士研究生。

國家自然科學(xué)基金項目（21006083，21376205）；浙江省自然科學(xué)基金項目（LY13B060002）。