何 微，朱 捷

（寧夏回族自治區(qū)食品檢測中心，寧夏 銀川 750004）

枸杞具有很高的食用價值，自古以來就有“春采枸杞葉，名天精草；夏采花，名長生草；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮”的說法。近些年來有越來越多的關(guān)于枸杞葉保健功能的研究[1-3],這些研究認為枸杞葉的藥效十分廣泛，具有解熱、治療糖尿病、高血壓、肝腎疾病、止咳化痰、護膚等療效。大量研究表明，枸杞葉中黃酮及蘆丁含量較高[4,5], 黃酮類化合物屬于植物次生代謝產(chǎn)物,具有多種生物活性，且具有抗氧化和降血脂作用，對預(yù)防動脈粥樣硬化有較好療效,蘆丁則具有抗炎、抗病毒、消除體內(nèi)自由基的作用[6,7]。因此如何高效的提取枸杞葉中總黃酮成為關(guān)注的焦點,本文主要在實驗室中進行提取工藝的方法考察,對于其能在工廠中順利的進行枸杞葉中總黃酮的提取中試實驗提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀（Agilent 1260）、紫外分光光度計（TU-1901）、分析天平（梅特勒）；蘆丁對照品（中國食品藥檢定研究院）；枸杞葉（寧夏農(nóng)林科學(xué)院提供）；乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁為分析純；水為超純水。

1.2 總黃酮的測定

1.2.1 對照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取蘆丁對照品（120 ℃干燥至恒重）約20 mg，至于100 mL量瓶中，加70%的乙醇超聲溶解并定容至刻度，即為約0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

1.2.2 樣品溶液的配制

精密稱取枸杞葉粗粉1.0 g，共54份（每種處理3個平行），分別采用超聲提取、回流提取、煮沸提取三種提取方式，每種提取方式中提取溶劑又分別為95%乙醇、75%乙醇、70%乙醇、60%乙醇、50%乙醇、熱水6種，提取時間均為1 h。提取后，過濾，用相應(yīng)溶劑洗滌濾渣并定容至100 mL的量瓶中，搖勻，待用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸取對照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于10 mL溶量瓶中，加水使成2.4 mL，依次加入5%NaNO2溶液0.4 mL，混勻，靜置6 min，加10%Al3NO3溶液0.4 mL，混勻，靜置6 min，加4% NaOH溶液1 mL，加水至刻度, 搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑作空白，在509 nm波長處測定吸光度，以蘆丁對照品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo) ，得回歸方程 y=0.001x-0.007 94，r= 0.999 66，表明蘆丁對照品在0.002~0. 04 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好[8]。

1.2.4 樣品測定

取供試品溶液1.0 mL，按1.2.3項下操作顯色，測定吸光度，以回歸方程求出樣品溶液中總黃酮的含量。

1.3 蘆丁含量的測定

色譜條件：色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%的冰醋酸（32:68）；檢測波長257 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量10 μ L。對照品溶液與樣品溶液的制備同 1.2項下的方法。見表1、圖1及圖2。

圖1 不同提取方式對枸杞葉中總黃酮含量的影響Fig.1 The influence of total flavonoids contents with different extraction methods in boxthorn leaf

圖2 不同提取方式對枸杞葉中蘆丁含量的影響Fig.2 The influence of rutin contents with different extraction methods in boxthorn leaf

2 實驗結(jié)果

通過表1、圖1及圖2分析得到，3種提取方式中，采用回流提取方式提取的總黃酮和蘆丁的含量最高，其中用不同濃度的乙醇作為提取液時提取效果最好。而以水為提取溶劑時，采用煮沸提取方式提取的總黃酮和蘆丁的含量比采用相同溶劑的其它兩種方式高。通過對比不同提取液的提取效率還可看出：75%乙醇、70%乙醇、60%乙醇的提取液中總黃酮和蘆丁的含量相近﹥50%乙醇﹥95%乙醇、熱水，但以 75%乙醇作為提取溶劑的提取效果最好。考慮到工廠的提取條件及有關(guān)文獻的報道，推薦采用回流提取方式以75%乙醇作為提取溶劑。

表1 不同提取方法提取枸杞葉總黃酮及蘆丁的考察結(jié)果(n=3)Table 1 Total flavonoids and rutin contents with different extraction methods in boxthorn leaf (n=3)

3 討 論

3.1 空白試劑的確定

在采用分光光度法測定枸杞葉中總黃酮時，枸杞葉中葉綠素的顏色比較深，為了考察葉綠素在測定總黃酮時是否有影響，通過測定石油醚脫色后的枸杞葉與正常的枸杞葉總黃酮的含量，發(fā)現(xiàn)兩者總黃酮的含量基本一致，說明在樣品提取過程中可不用脫色處理，可用試劑空白代替自身空白。

3.2 測定波長的選擇

在測定總黃酮的含量時，分別取了樣品溶液和對照品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法顯色，在250～650 nm波長范圍掃描，結(jié)果表明，兩者均在509 nm波長處有最大吸收，所以選擇509 nm為測定波長；在測定蘆丁含量時，分別取供試品溶液和對照品溶液，在190~400 nm的波長范圍掃描，結(jié)果表明，對照品在363 nm與257 nm的波長處有最大吸收，而供試品在329 nm波長處有最大吸收，在257 nm波長處有一肩峰。故選擇257 nm為測定波長。

［1］ 張玉璽，馬紅軍，何薇. 寧夏枸杞菜中總黃酮和蘆丁含量的動態(tài)變化研究[J]. 當(dāng)代化工, 2014, 43(12): 2509-2510.

［2］ 賀曉慧，賈孟輝，俞維，等. 寧夏枸杞葉基礎(chǔ)研究述要及應(yīng)用開發(fā)的前景[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2007，18(5): 1111-1112.

［3］ 牛東玲，馬婷婷，張自萍. 寧夏枸杞葉中總黃酮含量與抗氧化活性關(guān)系[J]. 寧夏大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2012, 33(1): 55-57.

［4］ 張穎，張立睦，周紅英，等．不同產(chǎn)地枸杞子中黃酮含量的測定[J]. 中國中醫(yī)藥科技，2004，11(2)：102-103．

［5］ 呂海英，林麗，潘云，等. 黑果枸杞葉總黃酮抗氧化和降血脂成分測定[J]. 新疆師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版, 2012, 31(2): 43-46.

［6］ 黃元慶，譚安民，沈泳，等. 枸杞黃酮類化合物清除氧自由基及對小鼠L1210 癌細胞能量代謝的抑制作用[J]. 衛(wèi)生研究，1998，27(2)：109-111.

［7］ 李淑珍. 黑果枸杞總黃酮制備工藝優(yōu)化和抗氧化、降血脂活性及成分研究[D]. 新疆: 新疆師范大學(xué), 2009.

［8］ 張穎. 蘆丁提取工藝的研究[J]. 臨床合理用藥, 2014, 7(4): 86-87.