曾凌曉 李欣然 金宏威 劉振明 張亮仁

(北京大學(xué)藥學(xué)院,天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191)

基于結(jié)構(gòu)和藥效團(tuán)特征的人類腺苷受體拮抗劑選擇性比較

曾凌曉 李欣然 金宏威 劉振明*張亮仁*

(北京大學(xué)藥學(xué)院,天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191)

腺苷受體是重要的治療靶標(biāo),選擇性腺苷受體拮抗劑具有廣泛的臨床應(yīng)用前景.本文通過(guò)同源模建構(gòu)建了腺苷A1、A2B和A3受體的結(jié)構(gòu),采用LigandScout 3.12軟件分別構(gòu)建了腺苷受體四種亞型的拮抗劑藥效團(tuán)模型.然后利用Schr?dinger程序中的Induced Fit Docking模塊完成受體-拮抗劑結(jié)合模式的預(yù)測(cè),并與藥效團(tuán)結(jié)果進(jìn)行比對(duì).結(jié)果發(fā)現(xiàn),由于結(jié)合口袋部位的殘基在家族間高度保守,模建得到的各個(gè)亞型受體的初始結(jié)構(gòu)活性口袋部位極為相似,無(wú)法用于亞型選擇性拮抗劑的識(shí)別.而腺苷受體四種亞型拮抗劑藥效團(tuán)的藥效特征與空間排布都不同,并與以前突變實(shí)驗(yàn)信息相吻合.研究結(jié)果說(shuō)明,結(jié)合口袋部位的優(yōu)化是模建中的關(guān)鍵步驟,基于配體的藥效團(tuán)模型所包含的一系列藥效特征元素如氫鍵受體、氫鍵供體、疏水基團(tuán)、芳環(huán)中心,可以很好地表征受體結(jié)合部位氫鍵、疏水空腔的位置及其方向.本文研究結(jié)果可以為進(jìn)一步的優(yōu)化同源模建結(jié)果,尋找新型的人類腺苷受體選擇性拮抗劑提供理論依據(jù).

藥效團(tuán); 人類腺苷受體; 拮抗劑; 選擇性

1 引 言

G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)是一個(gè)龐大的跨膜蛋白受體家族,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)800多個(gè)成員,主要分為5個(gè)亞家族:谷氨酸、視紫紅質(zhì)、粘附、Frizzled/ Taste2以及分泌素.1它們的共同結(jié)構(gòu)特征是肽鏈由N末端、7個(gè)跨膜α螺旋(TM1–TM7)、C末端、3個(gè)胞外環(huán)(ECL1–ECL3)及3–4個(gè)胞內(nèi)環(huán)(ICL1–ICL4)組成.GPCRs可以識(shí)別多種胞外配體,激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,引發(fā)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng).2GPCRs參與的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程廣泛調(diào)控感知、生殖、發(fā)育、生長(zhǎng)、代謝等多種生理過(guò)程,與糖尿病、心臟病、腫瘤、免疫和感染性疾病、精神疾病等重要疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān);3鑒于GPCRs在生理病理過(guò)程中的重要作用,其作為重要的“藥靶”一直以來(lái)在新藥研發(fā)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注,市場(chǎng)上30%–40%臨床用藥物都作用于GPCRs.4

腺苷是一類重要的內(nèi)源性核苷,參與包括核酸合成、氨基酸代謝、細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)在內(nèi)的多個(gè)關(guān)鍵生命過(guò)程,其生物學(xué)調(diào)控異常會(huì)導(dǎo)致心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和胃腸道系統(tǒng)等多種疾病.5腺苷在生物體內(nèi)的諸多生理作用是由腺苷介導(dǎo)的,其作為信號(hào)分子激活腺苷受體,產(chǎn)生相應(yīng)生理作用.腺苷受體屬于GPCRs超家族,在人體組織中分布廣泛.6目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了腺苷受體的4種亞型,并已被成功克隆,分別為:A1、A2A、A2B和A3.7,8腺苷受體是重要的治療靶標(biāo),選擇性腺苷受體拮抗劑具有眾多治療前景,包括心血管疾病、炎癥和神經(jīng)退行性疾病.9然而,在臨床應(yīng)用中針對(duì)腺苷受體藥物研發(fā)進(jìn)展緩慢,目前已知的腺苷受體拮抗劑發(fā)揮抑制作用的過(guò)程中,大部分都存在選擇性差的缺陷,由此導(dǎo)致臨床應(yīng)用中不良反應(yīng)的發(fā)生.5因此,針對(duì)腺苷受體選擇性拮抗劑的研究就顯得尤為重要,研究腺苷受體拮抗劑的特異性和選擇性對(duì)進(jìn)一步闡明其作用機(jī)理和開(kāi)發(fā)新拮抗劑均有重要意義.

計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法從方法學(xué)上主要分為兩種:基于受體的藥物設(shè)計(jì)和基于配體的藥物設(shè)計(jì).10晶體結(jié)構(gòu)是目前研究者了解GPCRs功能和進(jìn)行調(diào)控分子設(shè)計(jì)的基礎(chǔ),第一個(gè)被解析的GPCRs晶體結(jié)構(gòu)是牛視紫紅質(zhì).11由于結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,科學(xué)家開(kāi)發(fā)出新的方法來(lái)解決膜蛋白表達(dá)、溶解和結(jié)晶問(wèn)題的瓶頸,越來(lái)越多的GPCRs晶體結(jié)構(gòu)得到解析.1但從整個(gè)GPCRs家族來(lái)看,目前解析出來(lái)的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)量還是太少,對(duì)于腺苷受體家族,目前也只有腺苷A2A受體有晶體結(jié)構(gòu)解析出來(lái).因此大部分GPCRs靶蛋白的研究都是基于同源建模獲得的結(jié)構(gòu)而進(jìn)行的.12屬于同一亞家族的不同亞型有著不同的氨基酸序列、組織分布和藥理作用,但與此同時(shí)結(jié)合口袋部位的殘基往往在家族間高度保守.因此,模建具有受體亞型選擇性的結(jié)構(gòu)從而進(jìn)行選擇性配體的設(shè)計(jì)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn).13

相比于晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的缺乏,GPCRs具有豐富的配體數(shù)據(jù)信息.藥物分子在體內(nèi)發(fā)揮生理作用是與生物大分子相互作用的結(jié)果,受體與配體通過(guò)特定的結(jié)合部位產(chǎn)生相互作用.因此,特定的三維空間構(gòu)象對(duì)于分子呈現(xiàn)其藥效活性具有很重要的意義.從生物活性小分子的三維構(gòu)象出發(fā)分析藥物與受體的相互作用模式,是藥物分子設(shè)計(jì)與選擇性分析常用的策略.14基于配體的藥效團(tuán)設(shè)計(jì)是在靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)信息缺少時(shí)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的主要手段,其基本流程為:根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)特征的空間排列形式進(jìn)行分子疊合,得到對(duì)同一靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別,表現(xiàn)出相似藥效特性的一類分子所具有的共同特點(diǎn).15而藥效團(tuán)所包含的藥效特征元素如氫鍵受體(HBA)、氫鍵供體(HBD)、疏水基團(tuán)(HY)、芳環(huán)中心(RA),能夠反映出受體結(jié)合部位對(duì)應(yīng)的特征元素.

腺苷受體是一類研究相對(duì)成熟的GPCRs蛋白,包括本課題組在內(nèi),很多研究小組都對(duì)它們的調(diào)控分子進(jìn)行了廣泛的研究,并發(fā)現(xiàn)了多個(gè)系列的腺苷受體亞型拮抗劑.研究發(fā)現(xiàn)腺苷受體不同亞型調(diào)控分子的結(jié)構(gòu)之間存在著一些明顯的特征差異,考慮到小分子與受體結(jié)合時(shí)的互補(bǔ)和契合,這種差異是否也反映了結(jié)合狀態(tài)下受體蛋白空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的特征呢? 本文擬通過(guò)基于配體結(jié)構(gòu)的藥效團(tuán)和同源模建腺苷受體四種亞型的結(jié)構(gòu),比較分析腺苷受體不同亞型之間選擇性拮抗作用的內(nèi)在規(guī)律.

2 計(jì)算方法

2.1 同源模建

腺苷A1、A2B和A3受體同源模建所用的模板是A2A受體的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:4EIY),來(lái)源于PDB蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.rcsb.org).16A1,A2B和A3受體的序列(A1ID:P30542,A2BID:P29275,A3ID:P33765),均來(lái)自SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù).17同源模建均采用Accelrys公司的Discovery Studio 2.5(DS 2.5)18中的MODELER模塊進(jìn)行搭建,計(jì)算中選用的各項(xiàng)參數(shù)除特別說(shuō)明外均使用缺省值.

2.1.1 序列比對(duì)

首先對(duì)PDB蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的腺苷A2A受體晶體結(jié)構(gòu)做了初步處理,具體包括:刪除T4溶菌素蛋白,刪除水分子,刪除原始小分子配體,添加氫原子.序列比對(duì)采用的是DS 2.5中Align Sequence to Templates模塊,將A1,A2B和A3受體的氨基酸序列與處理后的模板蛋白A2A受體進(jìn)行比對(duì),確定模板蛋白與目標(biāo)蛋白氨基酸序列之間的殘基匹配情況.

2.1.2 模型的構(gòu)建

根據(jù)序列比對(duì)的結(jié)果,以腺苷A2A受體的蛋白拮抗?fàn)顟B(tài)晶體結(jié)構(gòu)為模板,采用DS 2.5中的Build Homology Models模塊分別對(duì)A1,A2B和A3進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源模建,由程序自動(dòng)生成10個(gè)模型,選取概率密度函數(shù)(PDF)對(duì)蛋白質(zhì)幾何性質(zhì)打分最高的模型.

2.1.3 模型的評(píng)價(jià)

得到的模型采用PROCHECK程序19進(jìn)行合理性評(píng)價(jià),PROCHECK主要用于評(píng)價(jià)模型中殘基與殘基之間的立體化學(xué)性質(zhì),考察殘基之間的φ和ψ兩個(gè)角度分布在Ramachandran圖中的分布是否合理.Ramachandran圖顯示了各個(gè)殘基間的φ和ψ這兩個(gè)角度是否出現(xiàn)在合理的區(qū)域.20在Ramachandran圖中,共有四個(gè)區(qū):最佳合理區(qū)(the most favored regions),額外合理區(qū)(additional allowed regions),一般合理區(qū)(generously allowed regions),不合理區(qū)(disallowed regions),以模板中的氨基酸在這四個(gè)區(qū)域分布的百分比來(lái)評(píng)價(jià)模型的好壞.

2.2 訓(xùn)練集的選擇

從ChEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://www.ebi.ac.uk/ chembl)21收集腺苷受體四個(gè)亞型的拮抗劑.使用本實(shí)驗(yàn)室夏杰博士建立的protocol流程在Pipeline Pilot 7.5軟件中對(duì)所有配體進(jìn)行拓?fù)湎嗨菩员容^,22,23以結(jié)構(gòu)多樣性為選擇原則,針對(duì)每一個(gè)腺苷受體亞型分別保留6個(gè)拮抗劑用于下一步的藥效團(tuán)模建.24

2.3 藥效團(tuán)模型的構(gòu)建

使用LigandScout 3.12軟件,25采用Omega-best方法,針對(duì)每個(gè)配體分子得到一組在合理的能量范圍內(nèi)具有一定代表性的化合物構(gòu)象.采用默認(rèn)參數(shù)建立了基于配體的藥效團(tuán)模型,根據(jù)Pharmacophore-Fit打分函數(shù),最終挑選每個(gè)亞型打分最高的模型作為最終的藥效團(tuán)模型.

2.4 分子對(duì)接

針對(duì)腺苷受體四種亞型,挑選出與最優(yōu)藥效團(tuán)模型匹配最好的配體分子,與對(duì)應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對(duì)接.

分子對(duì)接的過(guò)程采用Schr?dinger程序,26首先采用Protein Preparation Wizzard模塊對(duì)蛋白進(jìn)行預(yù)處理(包括核準(zhǔn)鍵級(jí)、查找殘基及原子重疊、生成氫鍵及能量最小化等工作);隨后使用LigPrep模塊分別對(duì)分子進(jìn)行能量最小化(使用OPLS_2005力場(chǎng))預(yù)處理;最后使用Induced Fit Docking模塊進(jìn)行誘導(dǎo)對(duì)接.

3 結(jié)果與討論

3.1 同源模型的評(píng)價(jià)

選擇了腺苷A2A受體的拮抗?fàn)顟B(tài)晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:4EIY)作為同源模建的模板蛋白,序列比對(duì)結(jié)果如圖1所示.腺苷A1受體與腺苷A2A受體的相似度(similarity)為69.2%,一致性(identity)為51.3%;腺苷A2B受體與腺苷A2A受體的相似度為77.2%,一致性為60.6%;腺苷A3受體與腺苷A2A受體的相似度為66.1%,一致性為41.3%.

使用PROCHECK程序評(píng)價(jià)模型結(jié)構(gòu)的立體化學(xué)參數(shù),此程序根據(jù)經(jīng)驗(yàn)比較所給蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與最合理的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間立體化學(xué)性質(zhì)的差異.通過(guò)程序生成的Ramachandran圖來(lái)表示所有氨基酸殘基骨架的二面角分布(表1,圖2).結(jié)果顯示,三個(gè)模建受體均沒(méi)有殘基處于不合理區(qū)域,因此通過(guò)同源模建獲得的腺苷A1、A2B和A3受體模型從總體上看結(jié)構(gòu)是合理的.

對(duì)于GPCRs的模建,由于都具有七次跨膜的保守性結(jié)構(gòu),主鏈的模建并不困難.由上述結(jié)果也能反映出模建初始模型在結(jié)構(gòu)合理性上達(dá)到要求.同源模建主要應(yīng)用于分子對(duì)接和虛擬篩選,為得到選擇性腺苷受體拮抗劑,要求模型具有結(jié)構(gòu)上的選擇性區(qū)分,這種差異主要體現(xiàn)在活性口袋關(guān)鍵氨基酸殘基的位置和角度上.然而當(dāng)我們比對(duì)模建的腺苷受體與初始模板的活性口袋殘基時(shí),發(fā)現(xiàn)模建得到的腺苷受體三個(gè)亞型結(jié)構(gòu)與初始模板蛋白非常相似,腺苷A1、A2B和A3受體模型與初始模板活性口袋殘基疊合均方根偏差(RSMD)分別為0.0087、0.0098和0.0072 nm(圖3).

圖1 腺苷A1(A),A2B(B)和A3(C)受體與腺苷A2A受體序列比對(duì)Fig.1 Sequence alignment of A2Aand A1(A),A2B(B),A3(C) adenosine receptors(AR),respectively

表1 腺苷受體模型PROCHECK評(píng)價(jià)結(jié)果Table 1 Results of PROCHECK of modeled adenosine receptor

這種活性口袋相似性的主要原因是,屬于同一亞家族的不同亞型的蛋白,其結(jié)合口袋部位的殘基往往在家族間高度保守.13從圖4可以看出,腺苷受體家族4個(gè)亞型的配體結(jié)合口袋殘基保守性較高,核心的配體–受體相互作用包括配體芳環(huán)體系與Phe1685.29(上標(biāo)代表氨基酸殘基在每個(gè)螺旋區(qū)和環(huán)區(qū)相對(duì)最保守的位置,Ballesteros-Weinstein編號(hào)法27)側(cè)鏈的π–π堆疊作用,Leu2496.51,Ile2747.39,Met1775.38的疏水相互作用,以及Asn2536.55的氫鍵作用,這些殘基對(duì)配體結(jié)合作用起到主要貢獻(xiàn).這種殘基之間的相似性為模建和基于受體–配體間相互作用設(shè)計(jì)選擇性調(diào)控分子帶來(lái)了困難.這也表明,不經(jīng)過(guò)優(yōu)化的同源模建粗模型即使?jié)M足結(jié)構(gòu)合理性,但與真實(shí)情況存在差距.因此,模建具有受體亞型選擇性的結(jié)構(gòu)從而進(jìn)行選擇性配體的設(shè)計(jì)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn),需要進(jìn)一步從配體出發(fā)分析不同亞型拮抗劑的分子結(jié)構(gòu)和藥效團(tuán)特征,進(jìn)而獲得可信的具有選擇性的模型結(jié)構(gòu).

圖2 腺苷受體模型的Ramachandran圖Fig.2 Ramachandran plots of modeled adenosine receptors

圖3 腺苷A2A受體活性口袋(A)及模建的腺苷A1受體(B)、腺苷A2B受體(C)、腺苷A3受體(D)與初始模板的結(jié)合口袋殘基疊合圖Fig.3 Binding pocket residues of A2AAR(A) and superimposition of binding pocket residues of the homology models of A1AR(B),A2BAR(C),A3AR(D) with initial template structure

圖4 腺苷受體四種亞型配體結(jié)合口袋殘基比較Fig.4 Residue variations in the ligand-binding pocket between four adenosine receptor subtypes Residues are colored according to their conservation:red,fully identical in all 4 subtypes;green,in 3 subtypes;blue,in 2 subtypes;purple,in only one subtype

3.2 訓(xùn)練集的選擇

從ChEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)所挑選的高選擇性拮抗劑中,根據(jù)配體多樣性篩選原則針對(duì)腺苷受體四種亞型分別構(gòu)建含有6個(gè)化合物的訓(xùn)練集(見(jiàn)圖5–圖8),訓(xùn)練集化合物活性值(Ki)見(jiàn)表2–表5.28–48

圖5 應(yīng)用于訓(xùn)練集的高選擇性腺苷A1受體拮抗劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.5 Chemical structure of highly selective A1AR antagonists for training set

表2 腺苷A1受體訓(xùn)練集化合物實(shí)測(cè)生物活性值列表Table 2 Experimental biological activity data of training set of A1AR

藥效團(tuán)模型中兩個(gè)重要藥效特征(氫鍵供體和氫鍵受體)表征配體和受體相互識(shí)別的氫鍵相互作用,疏水特征可表征藥物非極性區(qū)域與受體的非極性區(qū)域之間的疏水相互作用,芳香環(huán)主要參與藥物分子與受體中π電子離域系統(tǒng)相互作用,藥效團(tuán)中芳香環(huán)特征表征這一作用.

圖6 應(yīng)用于訓(xùn)練集的高選擇性腺苷A2A受體拮抗劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.6 Chemical structure of highly selective A2AAR antagonists for training set

表3 腺苷A2A受體訓(xùn)練集化合物實(shí)測(cè)活性值列表Table 3 Experimental biological activity data of training set of A2AAR

圖7 應(yīng)用于訓(xùn)練集的高選擇性腺苷A2B受體拮抗劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.7 Chemical structure of highly selective A2BAR antagonists for training set

3.3 藥效團(tuán)模型比較

采用LigandScout 3.12軟件中基于配體的藥效團(tuán)模塊構(gòu)建每個(gè)腺苷受體亞型的藥效團(tuán)模型,結(jié)果顯示腺苷受體四種亞型的拮抗劑均以氫鍵受體(HBA)、氫鍵供體(HBD)、疏水基團(tuán)(HY)、芳環(huán)中心(RA)為藥效團(tuán)的基本藥效元素.其中,RA是腺苷受體四個(gè)亞型藥效團(tuán)共有的藥效特征,并且都與各亞型高選擇化合物的雜環(huán)母核相對(duì)應(yīng).這與圖4中腺苷受體四個(gè)亞型配體結(jié)合口袋的保守氨基酸殘基相一致,處于5.29位置均為Phe殘基,腺苷A1受體的Phe1715.29,腺苷A2B受體的Phe1735.29,腺苷A3受體的Phe1685.29與腺苷A2A受體的Phe1685.29對(duì)應(yīng);在已解析的腺苷A2A受體晶體表明該位置的Phe殘基與配體形成π–π堆疊作用.49

表4 腺苷A2B受體訓(xùn)練集化合物實(shí)測(cè)活性值列表Table 4 Experimental biological activity data of training set of A2AAR

圖8 應(yīng)用于訓(xùn)練集的高選擇性腺苷A3受體拮抗劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.8 Chemical structure of highly selective A3AR antagonists for training set

表5 腺苷A2受體訓(xùn)練集化合物實(shí)測(cè)活性值列表Table 5 Experimental biological activity data of training set of A3AAR

但總體來(lái)講,腺苷受體四個(gè)亞型藥效團(tuán)的藥效特征與空間排布都不同.腺苷A1受體拮抗劑與受體活性位點(diǎn)之間的相互作用形式主要包含2個(gè)氫鍵受體、1個(gè)疏水中心和2個(gè)芳香環(huán).點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明,His2516.52、Thr913.36對(duì)拮抗劑的結(jié)合有著重要作用,與這里的藥效團(tuán)的氫鍵作用相對(duì)應(yīng).50,51

腺苷A2A受體拮抗劑與受體活性位點(diǎn)之間的相互作用形式主要包含2個(gè)氫鍵受體、1個(gè)氫鍵供體、1個(gè)疏水中心和3個(gè)芳香環(huán),藥效特征與已知晶體結(jié)構(gòu)受體–配體相互作用匹配良好.Phe1685.29和Asn2536.55在A2A拮抗劑和受體之間相互作用起著關(guān)鍵作用.52除了上面提到的保守氨基酸殘基Phe1685.29與配體的π–π堆疊作用和芳香環(huán)特征相匹配,雜環(huán)母核上的氫鍵供體特征與保守氨基酸殘基Asn2536.55的極性相互作用相匹配.呋喃環(huán)存在與Trp2466.48的疏水作用以及與His2506.52的π–π堆疊作用.

腺苷A2B受體拮抗劑與受體活性位點(diǎn)之間的相互作用形式主要包含2個(gè)氫鍵受體、1個(gè)疏水中心和2個(gè)芳香環(huán).研究表明,氨基酸His2516.52、Trp2476.48與配體之間存在疏水作用,這與藥效團(tuán)的疏水特征相對(duì)應(yīng).His2807.43和Asn2827.45與配體之間存在極性相互作用來(lái)穩(wěn)定配體,與藥效團(tuán)的氫鍵受體特征相對(duì)應(yīng).53,54與其他亞型藥效特征不同的一點(diǎn)是,腺苷A2B受體藥效團(tuán)模型配體的取代基部分包含一個(gè)氫鍵受體的藥效特征,與最佳匹配化合物的羰基相對(duì)應(yīng).這一特殊的藥效特征與文獻(xiàn)中報(bào)道的非保守氨基酸殘基Asn1865.42相對(duì)應(yīng),也說(shuō)明此處是腺苷A2B受體選擇性配體的獨(dú)有特征.54,55

腺苷A3受體拮抗劑與受體活性位點(diǎn)之間的相互作用形式主要包含2個(gè)氫鍵受體、1個(gè)氫鍵供體、1個(gè)疏水中心和2個(gè)芳香環(huán).且每個(gè)藥效團(tuán)與該受體的高活性高選擇性拮抗劑分子匹配均較吻合.氫鍵供體的藥效特征,與文獻(xiàn)報(bào)道殘基Ser2717.42和Trp943.36與配體產(chǎn)生氫鍵作用一致.疏水作用與Phe2396.44殘基相對(duì)應(yīng).56

圖9 腺苷受體四種亞型的最優(yōu)藥效團(tuán)模型及對(duì)應(yīng)結(jié)合口袋殘基Fig.9 The best pharmacophore models and corresponding ligand binding residues of four adenosine receptor subtypes(A,E,I) A1AR;(B,F,J) A2AAR;(C,G,K) A2BAR;(D,H,L) A3AAR.distance in nm

腺苷受體四亞型拮抗劑藥效團(tuán)的空間距離和角度圖如圖9(E–H)所示,結(jié)果顯示四類藥效團(tuán)不僅如上討論在藥效特征上存在差別,并且藥效團(tuán)的空間分布也不盡相同.由此可以看出,各藥效基團(tuán)之間均需滿足一定的空間限制,從而產(chǎn)生選擇性拮抗腺苷受體的活性作用.

與藥效團(tuán)對(duì)應(yīng)的腺苷受體四亞型活性口袋氨基酸殘基分布如圖9(I–L)所示,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腺苷A2A受體拮抗劑藥效團(tuán)模型與拮抗?fàn)顟B(tài)的晶體結(jié)構(gòu)匹配良好,而以腺苷A2A受體為模板模建得到的其他三個(gè)亞型受體初始結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵氨基酸殘基分布與對(duì)應(yīng)藥效團(tuán)模型存在差異,并且與模板蛋白疊合表現(xiàn)出的高度相似性都表明模建后的初始模型并不能反映腺苷受體家族各亞型之間結(jié)構(gòu)上選擇性的差異,需要進(jìn)一步對(duì)關(guān)鍵氨基酸殘基的位置進(jìn)行優(yōu)化.

圖10 腺苷受體四種亞型拮抗劑與對(duì)應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)相互作用圖Fig.10 Interaction diagram of antagonists of four adenosine receptor subtypes binding to corresponding structures(A) A1AR;(B) A2AAR;(C) A2BAR;(D) A3AR.The antagonists are displayed in two-dimensional chemical structure and the residues of protein are shown in circle.

3.4 腺苷受體與拮抗劑作用模式分析

將腺苷受體各亞型選擇性拮抗劑柔性對(duì)接到對(duì)應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)中,對(duì)接后蛋白與配體作用模式如圖10所示.結(jié)果顯示,各個(gè)亞型的腺苷受體與拮抗劑作用模式與上面得到藥效團(tuán)特征相匹配,四種亞型拮抗劑母核上的氫鍵作用和π–π堆疊作用與四種藥效團(tuán)中的氫鍵供體、氫鍵受體以及芳香環(huán)的藥效特征相一致.然而,對(duì)接結(jié)果與藥效團(tuán)結(jié)果還是存在一些差異.對(duì)接模式中顯示的氫鍵作用大多與保守殘基如Asn、Phe相關(guān),而將藥效團(tuán)結(jié)果顯示出的特異性殘基的氫鍵作用在對(duì)接結(jié)果中沒(méi)有體現(xiàn)出來(lái),如對(duì)接結(jié)果中腺苷A1受體與活性口袋深處殘基并沒(méi)有顯示出氫鍵相互作用.這意味著同源模建粗模型直接用于分子對(duì)接可能存在偏差,有些選擇性差異不能很好地體現(xiàn)出來(lái).

值得注意的一點(diǎn)是,由于在構(gòu)建藥效團(tuán)時(shí)挑選的是結(jié)構(gòu)多樣的訓(xùn)練集分子,這種結(jié)構(gòu)的差異性使得分子的取代基部位很難進(jìn)行疊合顯示出共同的藥效特征,而另一方面對(duì)接結(jié)果展示出了亞型特有拮抗劑的化學(xué)修飾對(duì)選擇性的影響,如研究表明在黃嘌呤的8位用芳基取代提高化合物對(duì)腺苷A2B受體的選擇性,57對(duì)接結(jié)果顯示取代基上的苯環(huán)與非保守性氨基酸Lys2697.32有著π–π堆疊作用(圖10C),這在一定程度上可以解釋取代基的改變對(duì)結(jié)合選擇性的影響.

4 結(jié) 論

本文基于受體結(jié)構(gòu)和配體藥效團(tuán)特征對(duì)人類腺苷受體四種亞型拮抗劑進(jìn)行比較,分析其選擇性原因.結(jié)果發(fā)現(xiàn),腺苷受體四種亞型拮抗劑藥效團(tuán)的藥效特征與空間排布都不同,并與以前突變實(shí)驗(yàn)信息相吻合.而由于結(jié)合口袋部位的殘基在家族間高度保守,模建得到的各個(gè)亞型受體的初始結(jié)構(gòu)活性口袋部位極為相似,將同源模建粗模型直接用于分子對(duì)接存在偏差,有些選擇性差異不能很好地體現(xiàn)出來(lái).

研究結(jié)果說(shuō)明,結(jié)合口袋部位的優(yōu)化是模建中關(guān)鍵步驟,基于配體的藥效團(tuán)模型所包含的一系列藥效特征元素如氫鍵受體、氫鍵供體、疏水基團(tuán)、芳環(huán)中心,可以很好地表征受體結(jié)合部位氫鍵、疏水空腔的位置及其方向.本文研究結(jié)果可以為進(jìn)一步的優(yōu)化同源模建結(jié)果,尋找新型的人類腺苷受體選擇性拮抗劑提供理論依據(jù).

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Comparison of the Selectivity of Human Adenosine Receptor Antagonists Based on Structure and Pharmacophore Features

ZENG Ling-Xiao LI Xin-Ran JIN Hong-Wei LIU Zhen-Ming*ZHANG Liang-Ren*
(State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs,School of Pharmaceutical,Peking University,Beijing 100191,P.R.China)

Adenosine receptors(ARs) are crucial therapeutic targets,and selective adenosine receptor antagonists are promising for numerous therapeutic applications.In this study,three dimensional models of human adenosine A1,A2B,and A3receptors(A1AR,A2BAR,A3AR,respectively) were generated by homology modeling.In addition,pharmacophore models of the antagonists of four human adenosine receptor subtypes were developed using the LigandScout 3.12 program.Furthermore,Induced Fit Docking module of Schr?dinger program was implemented to investigate receptor–ligand interactions.The results show that because of the subfamily-wide conservation of the core pocket residues,the ligand binding pockets of the three raw AR homology models are extremely similar,which poses challenges for subtype selective ligand recognition.However,the pharmacophore models of the four AR subtypes differ in pharmacophore features and spatial configuration,which are also consistent with previous site-directed mutagenesis studies.This indicates that binding site optimization is a crucial step in model generation,and the distributions for a set of pharmacophore features in ligand-based pharmacophore,including hydrogen bond acceptors,hydrogen bond donors,hydrophobic centroids,and aromatic rings,can reflect the position and direction characterization ofhydrogen bonds and hydrophobic cavities,which aid identification and characterization of binding sites.This study may provide a significant theoretical foundation for further raw model optimization in homology modeling and discovery of novel selective human adenosine receptor antagonists.

Pharmacophore; Human adenosine receptor; Antagonist; Selectivity

April 17,2015;Revised:May 25,2015;Published on Web:May 25,2015.

O641

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10.3866/PKU.WHXB201505253 www.whxb.pku.edu.cn

*Corresponding authors.ZHANG Liang-Ren,Email:liangren@bjmu.edu.cn;Tel:+86-10-82802567.LIU Zhen-Ming,Email:zmliu@bjmu.edu.cn;Tel:+86-10-82805514.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21272017) and Doctoral Fund of Ministry of Education of China(20090001120049).

國(guó)家自然科學(xué)基金(21272017)和教育部博士點(diǎn)基金(20090001120049)資助項(xiàng)目

? Editorial office of Acta Physico-Chimica Sinica