黃超，李歌歌，葉龍，柳俊，蔡興奎

遺傳育種

4x-2x雜交創(chuàng)制馬鈴薯新種質(zhì)

黃超，李歌歌，葉龍，柳俊，蔡興奎*

（華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院/華中農(nóng)業(yè)大學園藝植物生物學教育部重點實驗室/國家蔬菜改良中心華中分中心，湖北武漢430070）

以二倍體馬鈴薯‘USW4’和Solanum chacoense雜交產(chǎn)生的F1株系‘XD-3’為材料，檢測其2n花粉產(chǎn)率和花粉活力。研究結果表明，‘XD-3’能產(chǎn)生2n花粉，2n花粉產(chǎn)率約7.7%，且花粉活力較高，達74.75%。在此基礎上，開展了4x-2x雜交，進行了4個不同的雜交組合，平均雜交結實率為36.5%，但平均種子數(shù)/漿果僅0.67粒。4個不同的雜交組合共獲得19個雜交后代，2對父本特異的SSR引物檢測結果表明，有14個株系可以確認為真雜種；雜種植株的倍性檢測結果表明，7個為三倍體，7個為四倍體。大量三倍體的產(chǎn)生為n花粉的直接利用提供了一條新思路。

馬鈴薯；2n花粉；4x-2x雜交；三倍體

在馬鈴薯資源中，74%野生種和近緣栽培種為二倍體［1］。二倍體野生種具有抗病、抗蟲、抗霜凍、抗干旱等突出的目標性狀。因此是改良馬鈴薯普通栽培種極其有用的資源。育種家們嘗試將二倍體與四倍體進行雜交，但是二者的胚乳平衡數(shù)（Endosperm balance number，EBN）不同。馬鈴薯普通栽培種的EBN是4，而大多數(shù)二倍體野生種的EBN是2，在開展4x-2x雜交時，其胚乳平衡數(shù)比值為4：1，偏離了2：1，根據(jù)Johnston等［2］提出的假說，如果胚乳中母本和父本的EBN比值不等于2：1，就會發(fā)生胚乳退化現(xiàn)象，很難或者不能產(chǎn)生有性后代。因此，將馬鈴薯普通四倍體與二倍體野生種直接雜交很難獲得成功。

馬鈴薯2n配子的發(fā)現(xiàn)為利用二倍體野生資源，擴大栽培種的遺傳基礎提供了可能。2n配子即不減數(shù)的配子，在植物界廣泛存在。Mok和Peloquin［3］根據(jù)2n配子的遺傳效應，將其分為兩大類，即FDR（Firstdivision restitution，第一次分裂重組）型和SDR（Second division restitution，第二次分裂重組）型。關于馬鈴薯4x-2x雜交，前人已有很多相關的報道［4，5］。本研究以栽培種雙單倍體USW4 Solanum chacoense雜交產(chǎn)生的一個F1株系（命名‘XD-3’）為試驗材料，開展4x-2x雜交，旨在探索4x-2x雜交的授粉效率，為馬鈴薯野生資源的利用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

二倍體材料‘XD-3’為二倍體馬鈴薯USW4 S.chacoense雜交產(chǎn)生的F1植株；馬鈴薯四倍體栽培種有‘冀張薯8號’（J8）、‘鄭薯5號’（Z5）、‘鄂薯5號’（E5）、‘會薯2號’（H2）、‘鄂薯3號’（E3）和‘華恩1號’（HE1）。

1.2試驗方法

1.2.1材料種植

2013年10月，將生長4周左右的試管苗移栽到30 DN 30 cm的塑料缽中（栽培基質(zhì)為1：1的營養(yǎng)土和泥炭土），每份材料種植10缽，每缽2株。試驗在華中農(nóng)業(yè)大學蔬菜改良中心華中分中心的玻璃溫室內(nèi)進行，于2014年2～4月完成雜交。

1.2.2XD-3的2n花粉和花粉活力檢測

從剛開放的花蕾中采集花粉，每個株系隨機選取3個植株，每株采集3個花蕾，將9朵花的花粉混勻，用棉棒蘸取少許花粉彈在載玻片上，用1%醋酸洋紅染色5 min，輕輕蓋上蓋玻片，在普通顯微鏡下統(tǒng)計可育花粉的比率。醋酸洋紅染色可育花粉為紅色，不育花粉染不上色且形狀不規(guī)則，以‘鄭薯5號’、‘鄂薯3號’、‘鄂薯5號’和‘華恩1號’的花粉為對照。2n花粉檢測時，按照呂文河等［6］報道的標準進行，至少觀察200個花粉粒，測定2n花粉粒的數(shù)量。

1.2.3雜交授粉與種子處理

馬鈴薯雜交授粉在上午9～11點完成。將獲得的漿果用0.1%的升汞消毒5 min，無菌水漂洗3次；在工作臺內(nèi)切開，直接取種子置于MS無糖培養(yǎng)基附加1.5 mg/L GA3上，放置于培養(yǎng)溫度（23 i 1）℃，光周期16 h/d，光照強度3 000～4 000 lx的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)；待種子發(fā)芽后，進行單株擴繁，對應編號。編號方法如冀張薯8號 XD-3的后代，第一個植株為J8XD-1，依次類推；鄂薯5號XD-3的后代為E5XD-1等。

1.2.44x-2x后代的雜種鑒定

利用小量提取法提取植株的基因組DNA。利用父本特異的SSR引物進行擴增，擴增反應程序為95℃預變性3 min，95℃變性30 s，Tm退火30 s，72℃延伸1 min，第二步到第四步循環(huán)35次，72℃5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)9%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。父本XD-3的特異SSR引物信息見表1。

1.2.54x-2x后代的倍性鑒定

采用德國Partec公司的Partec Cystain UV Precise P試劑盒提取核DNA并染色，每次測量的細胞數(shù)不少于5 000個。植物的倍性與其DNA含量成正比，以二倍體野生種S.chacoense為對照，峰值設置于50。所有待測植株的DNA含量分布曲線由流式細胞儀自動生成。數(shù)據(jù)分析采用Partec公司的DPAC軟件進行。

1.2.6數(shù)據(jù)分析

采用Excel計算平均值和標準差；花粉活力先進行反正弦處理，采用SPSS進行方差分析，鄧肯氏新復極差法（SSR）進行多重比較。

表1　父本特異的SSR引物信息Table 1 Information of specific SSR primers on male parent

2　結果與分析

2.1XD-3的2n花粉和花粉活力檢測

XD-3能否產(chǎn)生2n花粉是4x-2x雜交的關鍵，依據(jù)花粉粒直徑大小判斷其是n或2n花粉。圖1-A展示的為2n花粉粒，圖1-B為n花粉粒。在觀察統(tǒng)計701個XD-3花粉粒中，有54個為2n花粉粒，占被檢測花粉的7.7%。

圖1　XD-3的n和2n花粉粒Figure 1 n pollen and 2n pollen of XD-3

表2　不同材料的花粉活力的比較Table 2 Comparison of pollen vigor on different potato materials

表3　4x-2x雜交授粉情況Table 3 Results of 4x-2x cross

不同材料的花粉活力檢測結果見表2，從表2中可以看出，XD-3的花粉活力最高，達74.75%，且顯著高于對照品種，表明XD-3花粉的孕性最強，適宜做父本。

2.24x-2x雜交

以XD-3為父本，與4個不同的馬鈴薯栽培種雜交結果見表3。從表3中可以看出，不同雜交組合的結實率差異較大，以‘冀張薯8號’為母本時最高達51.1%，而‘鄭薯5號’為母本時最低，僅10.4%，平均的結實率為36.5%?？偟膩碚f，每漿果的種子數(shù)較少，大部分漿果內(nèi)部變黑壞死；以‘會薯2號’為母本時，每漿果種子數(shù)最高，達5.67個，而以‘冀張薯8號’為母本時最低，僅0.26個，平均每漿果種子數(shù)為0.67個。不同雜交組合的種子發(fā)芽率也不高，大部分種子發(fā)育不正常，并沒有生命力，發(fā)芽率為5.88%～40.00%，平均為25.00%。4個不同的雜交組合共獲得19個雜交后代。

2.34x-2x雜交后代的鑒定

本研究條件下所獲得19個雜交后代，是否為真雜種？利用父本特異的SSR引物進行擴增，STM1104的擴增結果見圖2。圖2中的箭頭所示為父本的特異帶型，大小約190 bp；另‘冀張薯8號’與‘XD-3’雜交組合中，‘XD-3’還擴增出另一條約170 bp的特征帶。只要在后代中檢測出父本的特異性條帶，即可確認為雜種。

利用2個SSR引物檢測的結果列于表4，“√”表示具有父本的特征帶，而“ ”表示不具有父本的特征帶；在被檢測的19個株系中，有14個株系可以確認為真雜種，另外J8XD-8、J8XD-11、E5XD-2、E5XD-4和E5XD-7尚不能確定其是否為雜種。

圖2　引物STM1104對4個雜交組合的擴增結果Figure 2 The amplification results of progeny and their parents with primer STM1104

表4　不同引物對雜交后代的擴增結果Table 4 Amplification results of hybirds with different primers

2.4倍性鑒定

采用流式細胞儀對14個體細胞雜種進行了倍性鑒定，將對照二倍體的峰值設置在50（圖3-A），則測定峰值為75表示為三倍體（圖3-B），峰值為100表示為四倍體（圖3-C）。鑒定結果顯示，14個被檢測植株中，有7個株系為四倍體，7個株系為三倍體。推測產(chǎn)生三倍體的原因是XD-3的n（n= 1x）花粉與2x雌配子結合，發(fā)育而成的完整植株。

圖3　流式細胞儀分析倍性Figure 3 Ploidy analysis by flow-cytometry

3　討論

2n配子的產(chǎn)生是減數(shù)分裂異常導致的結果，也是植物在長期進化過程中自身對環(huán)境的一種適應行為［7］。研究表明，2n配子的產(chǎn)率高低受植物年齡、極端溫度、日照長度、季節(jié)和肥料等多種因素影響［8-10］。呂文河等［6］測定了92份二倍體馬鈴薯野生種的2n配子產(chǎn)率，并與四倍體栽培種‘春薯5號’或‘大西洋’（Atlantic）雜交，統(tǒng)計雜交授粉的漿果數(shù)和單果種子數(shù)。研究結果表明，選擇2n配子產(chǎn)率高的二倍體作父本可以提高4x-2x雜交的坐果率和種子數(shù)/漿果。肖增寬等［11］開展了3個4x-2x雜交組合研究，3個雜交組合的平均種子數(shù)/漿果達29.05粒，其對應的3個二倍體材料平均2n花粉產(chǎn)率為54.27%。本研究中XD-3的2n配子率僅為7.7%，遠遠低于報道的2n配子產(chǎn)率［6，11］，產(chǎn)生的種子數(shù)/漿果也很低，高的組合5.67粒，低的組合0.26粒，平均0.67粒。推測可能的原因是少數(shù)的2n花粉與母本的雌配子結合，形成正常的四倍體種子；而大部分的雌配子只能與n花粉結合，形成三倍體胚，這些三倍體的胚可能無法正常發(fā)育而導致敗育，最終未能形成種子。因此提高二倍體2n花粉的產(chǎn)率，可以提高雌配子與2n花粉相遇結合的概率，從而提高雜交授粉的坐果率和單果種子數(shù)，這對于利用4x-2x雜交育種轉移二倍體的優(yōu)良性狀是十分必要的。

自然界中產(chǎn)生三倍體馬鈴薯是比較困難的，三倍體來源有兩個途徑，一是二倍體通過已減數(shù)配子與未減數(shù)配子融合形成，二是通過四倍體和二倍體雜交而形成［12］。例如，Hawkes［13］認為三倍體S.chaucha是二倍體S.phureja或S.stenotomum和四倍體S.tuberosum的雜交后代；在南美洲的二倍體馬鈴薯種中，產(chǎn)生2n配子的現(xiàn)象很普遍，這就更容易發(fā)生不同倍性水平馬鈴薯種間的基因流動［13，14］。然而在4x-2x雜交時，后代多為四倍體，這是因為2x雌配子在與x配子受精過程中產(chǎn)生了五倍體的胚乳，而五倍體胚乳是沒有生活力的，所以較難獲得三倍體后代［2］。Vanbreukelen［15］利用活體熒光技術比較了富利亞種2n花粉和n花粉在柱頭上生長快慢的研究結果表明，2n花粉都比n花粉生長快，使得2n花粉受精的胚珠數(shù)多，從而可以解釋4x-2x產(chǎn)生大量四倍體雜種的原因。在本研究中，4個不同的雜交組合共獲得19個雜交后代，2對父本特異的SSR引物檢測結果表明，有14個株系可以確認為真雜種；雜種植株的倍性檢測結果表明，7個為四倍體，7個為三倍體。三倍體植株在地里種植，生長勢良好，部分的三倍體植株能夠正常的開花，且花粉具有正?；盍Α＜僭O這些三倍體種植可以直接和四倍體雜交，將為利用n花粉直接和四倍體雜交，轉移其優(yōu)良性狀，為馬鈴薯栽培種的遺傳改良提供更多的材料，為不能產(chǎn)生2n配子的二倍體野生種利用提供了新途徑。

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Creation of New Potato Germplasms by 4x-2x Cross

HUANG Chao,LIGege,YE Long,LIU Jun,CAIXingkui*
(College of Horticulture and Forestry Sciences/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology(HAU),Ministry of Education/National Center for Vegetable Improvement(CentralChina),Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei430070,China)

Diploid'XD-3',a F1progeny from a cross of Solanum chacoense and cultivated diploid'USW4',was crossed to fourtetraploid potato varieties(2n=4x)as male parent.The results showed thatdiploid'XD-3'produced 7.7%2n gamete and pollen viability was 74.75%.However,the total pollination efficiency was low and the average successful pollination percentage over four different cross combinations was 36.5%,and the average seed number per berry was 0.67.The identification results ofthe progenies showed that14 outof19 were hybrids which exhibited SSRspecific bands of'XD-3'.The analysis of the ploidy showed thatseven hybrids were triploid and seven were tetraploid.The triploid might provide a new approach to make use n pollen ofwild species directly.

potato;2n pollen;4x-2x cross;triploid

S532

A

1672—3635（2015）04-0193-06

2015-07-11

湖北省自然科學基金重點項目（2015CFA104）；公益性行業(yè)專項（201303007）；教育部創(chuàng)新團隊項目（IRT13065）。

黃超（1988-），男，碩士研究生，從事馬鈴薯遺傳育種研究。

（Corresponding author）：蔡興奎，副教授，博士，主要從事馬鈴薯種質(zhì)資源研究，E-mail：caixingkui@mail.hzau.edu.cn。