丁偉偉，楊　程，徐增梅，童佳兵，陸　梅，童祥麗，李澤庚（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥3003；.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合肥30038）

·實驗研究·

陽和平喘顆粒對哮喘大鼠肺組織形態(tài)學(xué)及血清IL-17、TNF-α和IFN-γ表達(dá)的影響*

丁偉偉1，楊程2，徐增梅1，童佳兵2，陸梅1，童祥麗1，李澤庚1
（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合肥230038）

［目的］探討陽和平喘顆粒（YHPC）對哮喘大鼠肺組織形態(tài)學(xué)及血清白介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）表達(dá)的影響，從抗炎和提高免疫功能方面探討陽和平喘顆粒治療支氣管哮喘的作用機制。［方法］SD大鼠90只隨機分為6組，每組15只，分別為正常組（N組）、模型組（M組）、陽和平喘顆粒低、中、高劑量治療組（YHPC-L、YHPC-M和YHPC-H組）和地塞米松組（DXM組）。其中，M、YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H和DXM組均采用國際通用的方法，即卵蛋白（OVA）腹腔注射致敏及聯(lián)合霧化吸入激發(fā)建立哮喘模型，同時，應(yīng)用氫化可的松進(jìn)行腹腔注射以復(fù)制腎陽虛模型，N組使用生理鹽水作為對照。蘇木精-伊紅（HE）染色檢測各組大鼠肺組織病理學(xué)變化，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測各組大鼠血清IL-17、TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平的變化。［結(jié)果］與N組相比，M組大鼠血清IL-17、TNF-α顯著升高（P＜0.01），IFN-γ明顯降低（P＜0.01）；與M組相比，YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H和DXM組大鼠血清IL-17、TNF-α均發(fā)生下降（P＜0.01），IFN-γ則明顯上升（P＜0.01）；與DXM組相比，YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H組對IL-17和TNF-α的作用效果小于DXM（P＜0.01），而對IFN-γ的作用效果強于DXM（P＜0.01）。［結(jié)論］陽和平喘顆粒可通過抗炎及增強機體免疫力而達(dá)到支氣管哮喘標(biāo)本兼治的目的。

支氣管哮喘；陽和平喘顆粒；地塞米松；白介素-17；腫瘤壞死因子-α；干攏素-γ

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞（嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞等）和細(xì)胞因子參與介導(dǎo)的氣道慢性變應(yīng)性疾病，近年來其發(fā)病率和病死率呈上升趨勢［1-3］。陽和平喘顆粒（YHPC）由陽和湯和平喘湯綜合化裁而成，具有溫陽納氣、宣肺平喘、標(biāo)本兼治之功效，本研究擬通過觀察陽和平喘顆粒對腎陽虛型哮喘大鼠血清白介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）的影響，分別從抗炎和增強機體免疫功能的角度探討陽和平喘顆粒治療支氣管哮喘的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雄性SD大鼠90只，清潔級，體質(zhì)量（200±20）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：皖醫(yī)實動準(zhǔn)字01號。

1.2藥物及試劑陽和平喘顆粒由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，批號20120511；地塞米松、卵蛋白（OVA），購自Sigma公司；IL-17、TNF-α和IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，購自R&D公司。

1.3模型復(fù)制90只雄性SD大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為6組，每組15只，分別為正常組（N組）、哮喘模型組（M組）、陽和平喘顆粒低、中、高劑量組（YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H組）和地塞米松組（DXM組），適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實驗。參考有關(guān)文獻(xiàn)［4］并加以改進(jìn)，應(yīng)用OVA致敏和激發(fā)的方法進(jìn)行哮喘模型的復(fù)制，其中M、YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H和DXM組分別在實驗的第1天和第7天分兩點進(jìn)行腹腔注射OVA1mL（含OVA10mg，氫氧化鋁20 mg），每點0.5 mL，實驗第15天開始將致敏大鼠置于霧化箱中，以恒壓400 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）霧化吸入1%OVA 15 min，每日1次，持續(xù)14 d，而N組在致敏和激發(fā)階段均使用生理鹽水作為對照。同時，在哮喘模型的基礎(chǔ)上分別于實驗第14、16、18、19、22、26、28天按每只1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、4.0、8.0 mL腹腔分兩點注射濃度為1 mg/mL的氫化可的松，直至出現(xiàn)呼吸頻率加快、氣急、咳嗽、靜臥少動、便溏、毛發(fā)倒伏、舌色發(fā)青、畏冷等癥狀，即為造模成功。同時，N組在致敏、激發(fā)、腎陽虛模型復(fù)制階段均使用生理鹽水作為對照。

1.4給藥方法實驗第28天開始，YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H組大鼠分別按1.62、3.24和6.28 g/kg的劑量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行灌胃給藥，DXM組按0.5 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥2周。同時，N組和M組以等量的生理鹽水進(jìn)行灌胃2周，處死動物前12 h停止給藥并禁食。

1.5標(biāo)本采集各組大鼠分別給予3%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈取血3 mL，3 000 r/min離心10 min，留取上清液，-80℃保存?zhèn)溆?。同時，常規(guī)留取肺組織進(jìn)行甲醛固定。

2　指標(biāo)觀測

2.1證候?qū)W觀察M、YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H 和DXM組大鼠先后出現(xiàn)呼吸加快、點頭呼吸、咳嗽、毛發(fā)倒伏、口唇發(fā)紺、畏寒、縮聚成團(tuán)、站立不穩(wěn)、精神萎靡、便溏等癥狀，同時，伴有各組均有少數(shù)不等的大鼠死亡。N組則無上述癥狀，無死亡現(xiàn)象。

2.2實驗室指標(biāo)檢測

2.2.1肺組織病理學(xué)表現(xiàn)常規(guī)留取肺組織后，應(yīng)用10%甲醛溶液進(jìn)行固定、石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。光學(xué)顯微鏡下隨機觀察5個氣道橫切面圖像，比較分析各組大鼠肺組織病理學(xué)改變情況。

2.2.2血清IL-17、TNF-α和IFN-γ含量檢測將保存于-80℃血清進(jìn)行解凍處理，按ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行IL-17、TNF-α和IFN-γ檢測，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.3統(tǒng)計方法應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析，每組數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1肺組織病理學(xué)表現(xiàn)HE染色結(jié)果顯示，N組：氣道壁結(jié)構(gòu)完整、輪廓清晰，無充血、水腫、滲出等表現(xiàn)，小氣道及血管周圍未見炎性細(xì)胞浸潤，無支氣管柱狀上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞增生（圖1-A）；M組：支氣管壁皺襞增多、斷裂，支氣管上皮細(xì)胞增生明顯，基底膜下平滑肌增厚，管腔明顯狹窄變形，小氣道及血管周圍有大量炎癥性細(xì)胞浸潤，其中以嗜酸性粒細(xì)胞片狀浸潤為主，支氣管柱狀上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞增生明顯，氣道內(nèi)黏液分泌增多（圖1-B）。YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H和DXM組：小氣道及血管周圍少量炎性細(xì)胞浸潤，但無M組顯著（圖1-C、D、E、F）。

圖1　肺組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE染色×200）

3.2血清IL-17、TNF-α和IFN-γ含量變化見表1。

表1　陽和平喘顆粒對大鼠血清IL-17、TNF-α和IFN-γ的影響ng/L

從表1可以看出，與N組相比，M組IL-17、TNF-α顯著升高（P＜0.01），IFN-γ明顯降低（P＜0.01）；與M組相比，YHPC-L、YHPC-M和YHPC-H 組IL-17、TNF-α均發(fā)生下降（P＜0.01），IFN-γ顯著上升（P＜0.01），且具有一定的劑量依賴效應(yīng)；與DXM組相比，YHPC-L、YHPC-M和YHPC-H組IL-17、TNF-α改變程度小于DXM組（P＜0.01），而IFN-γ的變化程度則強于DXM組（P＜0.01）。

4　討論

支氣管哮喘是呼吸系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，全世界約有3億人患有支氣管哮喘，中國至少有2 000萬支氣管哮喘患者，并且近年來其發(fā)病率和病死率呈上升趨勢［5］。中醫(yī)學(xué)將其歸屬于“哮病”、“喘證”范疇，并將病因病機歸納為肺不能布散津液，脾不能運輸精微，腎不能蒸化水液，認(rèn)為痰飲伏肺是其標(biāo)，腎氣不足是其本。劉恩順等［6］通過對支氣管哮喘中醫(yī)證候及證候要素的流行病學(xué)調(diào)查分析表明，在辨證論治的基礎(chǔ)上針對不同的證候特點來遣方用藥，有利于提高支氣管哮喘的防治水平。張?zhí)N卓等［7］通過研究分析咳喘方治療痰熱郁肺型支氣管哮喘的臨床療效發(fā)現(xiàn)，咳喘方的治療效果和潑尼松相當(dāng)（P＜0.05），表明中醫(yī)藥對支氣管哮喘有著肯定的臨床療效。陽和平喘顆粒是由陽和湯和平喘湯綜合化裁而成，立足于“哮喘以痰飲內(nèi)伏為標(biāo)，腎氣不足為本”，方中炙麻黃宣肺平喘，鹿角膠、淫羊藿溫腎納氣定喘，當(dāng)歸溫通調(diào)營平喘，肺腎同治，溫宣相宜，補散結(jié)合，具有顯著的臨床療效［8］。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，Th1/Th2細(xì)胞功能失衡是支氣管哮喘發(fā)病的關(guān)鍵機制，主要表現(xiàn)為Th1型細(xì)胞功能低下，Th2型細(xì)胞功能亢進(jìn)［9-11］。IL-17主要由激活的CD4+和CD8+T細(xì)胞所產(chǎn)生，屬Th2型細(xì)胞因子，具有強烈的致炎性，可通過多種方式、多種途徑參與支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展。IL-17可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞、支氣管成纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞釋放促炎癥性細(xì)胞因子白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、粒-巨細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、趨化因子CXCL-1和CXCL-8等，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織損害［12-14］。龔臣等［15］研究表明，支氣管哮喘患者外周血中IL-17的水平顯著高于正常人，且與嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)呈中度正相關(guān)，提示IL-17參與了支氣管哮喘的發(fā)病。Candrian等［16］研究表明，IL-17在支氣管哮喘發(fā)生和急性加重時會顯著升高，促進(jìn)肺部嗜酸性粒細(xì)胞聚集，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性及氣道重塑。

TNF-α是由多種細(xì)胞分泌的前炎癥性細(xì)胞因子，亦屬于Th2型細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)功能。研究表明，TNF-α可促進(jìn)支氣管內(nèi)致敏活性物質(zhì)的釋放，進(jìn)而誘發(fā)支氣管哮喘的發(fā)生［17-18］。Puthothu等［19］研究發(fā)現(xiàn)，吸入或者靜脈注射TNF-α可導(dǎo)致氣道阻力延遲性增高和氣道高反應(yīng)性，同時伴有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，表明TNF-α可能在啟動支氣管哮喘中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

IFN-γ是由Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有抗炎抗病毒、增強機體免疫力等生物學(xué)活性。申鴻等［20］研究表明，與健康對照組相比，支氣管哮喘患者血清IFN-γ水平顯著降低，而白介素-4（IL-4）、IgE的水平則顯著升高，兩者呈負(fù)相關(guān)（r=-0.49、r=-0.52），提示IFN-γ、IL-4和IgE對患者病情的判斷及治療具有重要的臨床意義。過紅霞［21］通過使用IFN-γ佐治小兒支氣管哮喘的研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ具有顯著的臨床療效，值得臨床推廣應(yīng)用。

本研究發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量的陽和平喘顆粒均可降低腎陽虛型哮喘大鼠血清IL-17、TNF-α的含量，同時提高IFN-γ的含量，表明陽和平喘顆?？赏ㄟ^抗炎及提高機體免疫力進(jìn)而達(dá)到治療支氣管哮喘的效果。同時，研究還發(fā)現(xiàn)，陽和平喘顆粒降低IL-17、TNF-α的程度低于地塞米松，而提高IFN-γ水平的程度強于地塞米松，推測陽和平喘顆粒主要通過增強機體免疫功能進(jìn)而達(dá)到“宣肺以平喘，溫陽以補腎”標(biāo)本兼治的目的，這是課題組首次就陽和平喘顆粒治療支氣管哮喘的療效機制進(jìn)行比較分析，為后期深入研究其作用機制奠定了基礎(chǔ)。

［1］Lin WY，Muo CH，Ku YC，et al.Risk of subsequent asthma in children with febrile seizures:a nationwide populationbased retrospective cohort study［J］.Pediatr Neurol，2014，51 （6）:795-799.

［2］Cheng S，Chen H，Wang A，et al.Exclusion of IL-21 in the pathogenesis of OVA-induced asthma in mice［J］.Int J Clin Exp Med，2014，7（10）:3203-3208.

［3］Lai H，Rogers DF.New pharmacotherapy for airway mucus hypersecretion in asthma and COPD:targeting intracellular signaling pathways［J］.J Aerosol Med Pulm Drug Deliv，2010，23（4）:219-231.

［4］劉貴穎，張慧琪，尹新中，等.疏風(fēng)通絡(luò)方對哮喘大鼠嗜酸細(xì)胞跨膜遷移相關(guān)因子VCAM-1/PI3K/Rac-1/NOX2/ NOX4/SHP-2表達(dá)影響的研究［J］.天津中醫(yī)藥，2013，30 （3）：159-163.

［5］Lee MY，Shin IS，Jeon WY，et al.Pinellia ternate Breitenbach attenuates ovalbumin-induced allergic airway inflammation and mucus secretion in a murine model of asthma［J］. Immunopharmacol Immunotoxicol，2013，35（3）:410-418.

［6］劉恩順，孫增濤，封繼宏，等.1010例支氣管哮喘患者中醫(yī)證候及證候要素的臨床流行病學(xué)調(diào)查［J］.天津中醫(yī)藥，2009，26（10）：357-359.

［7］張?zhí)N卓，劉貴穎.咳喘方治療痰熱郁肺型支氣管哮喘臨床療效觀察［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，25（3）：168-169.

［8］朱慧志，季紅燕，張念志，等.陽和平喘顆粒對支氣管哮喘慢性持續(xù)期寒哮證氣道炎癥的影響［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2010，22（4）：310-311.

［9］楊季國，張春玲，徐燕立，等.平喘Ⅰ號對呼吸道合胞病毒哮喘小鼠TNF-α、ET-1影響的研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（8）：1674-1675.

［10］Kaur M，Reynolds S，Smyth LJ，et al.The effects of corticosteoids on cytokine production from asthma lung lymphocytes［J］.Int Immunopharmacol，2014，23（2）:581-584.

［11］張雄飛，朱盛山，黃娟萍，等.喘平方調(diào)節(jié)哮喘模型豚鼠Th1/Th2平衡的實驗研究［J］.中成藥，2013，35（9）：2016-2019.

［12］趙四林，王偉.加味二仙丸對支氣管哮喘臨床緩解期患者血清白細(xì)胞介素及干擾素-γ的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（4）：16-17.

［13］Song C，Luo L，Lei Z，et al.IL-17-producing alveolar macrophages mediate allergic lung inflammation related to asthma［J］.J Immunol，2008，181（9）:6117-6124.

［14］Vos R，Verleden SE，Ruttens D，et al.Azithromycin and the treatment of lymphocytic airway inflammation after lung transplantation［J］.AmJTransplant，2014，14（12）:2736-2748.

［15］龔臣，鄧靜敏，韋旋，等.支氣管哮喘患者血清白介素17水平及吸入沙美特羅替卡松對其影響的研究［J］.中華哮喘雜志：電子版，2013，7（4）：1-4.

［16］Candrian S，Tosbe D，Couillin I，et al.Interleukin-17 is a negative regulator of established allergic asthma［J］.J Exp Med，2006，203（12）:2715-2725.

［17］覃宏志.腫瘤壞死因子α、超敏C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-10在支氣管哮喘患者中檢測的臨床價值分析［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8（31）：108-109.

［18］Berry MA，Hargadon B，Shelley M，et al.Evidence of a role of tumor necrosis factor alpha in refractory asthma［J］.N EngI J Med，2006，354（7）:697-708.

［19］Pathothu B，Bierbaum S，Kopp MV，et al.Association of TNF-alpha with severe respiratory syncytial virus infection and bronchial asthma［J］.Pediatr Allergy Immunol，2009，20 （2）:157-163.

［20］申鴻，周萍，白香妮.支氣管哮喘患兒血清白細(xì)胞介素-4、干擾素-γ及免疫球蛋白E水平測定及臨床意義［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，9（25）：109-112.

［21］過紅霞.干擾素-γ佐治小兒支氣管哮喘68例臨床療效觀察［J］.現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2011，23（6）：632-634.

Effects of Yanghe Pingchuan granules on the expression of IL-17，TNF-α and IFN-γ in rat asthma serum

DING Wei-wei1，YANG Cheng2，XU Zeng-mei1，TONG Jia-bing2，LU Mei1，TONG Xiang-li1，LI Ze-geng1
（1.Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230031，China；2.First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230038，China）

［Objective］To investigate the effects of Yanghe Pingchuan granules on the expression level of IL-17，TNF-α and IFN-γ in rat asthma serum.［Methods］Ninty SD rats were randomly divided into six groups which were normal group（N group），model group（M group），low，middle and high-dose of Yanghe Pingchuan group （YHPC-L，YHPC-M and YHPC-H group）and dexamethasone group（DXM group）.For inducing asthma，the rats were sensitized by intraperitoneal injection with ovalbumin（OVA），and then activated by inhalation.Furthermore，dexamethasone was applied to replicate kidney-deficiency rat asthma model，while the N group were treated with saline as a control.HE staining was used to evaluate the pathological changes of lung tissue in each groups，ELISA was used to detect changes of IL-17，TNF-α and IFN-γ in the rat serum.［Results］The expression of IL-17 and TNF-α is significantly higher in M group than in N group，but IFN-γ is obviously lower.Compared with M group，the levels of IL-17 and TNF-α decreased notably（P＜0.01），while IFN-γ levels increased（P＜0.01）.The effect of Yanghe Pingchuan Granules on IL-17 and TNF-α is lower than DXM（P＜0.01），whereas is stronger than DXM on IFN-γ（P＜0.01）.［Conclusion］Yanghe Pingchuan granules could cure bronchial asthma by anti-inflammatory，enhancing immunity and reducing pathological changes.

Bronchial asthma；Yanghe Pingchuan granules；Dexamethasone；IL-17；TNF-α；IFN-γ

R562.25

A

1673-9043（2015）03-0148-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.03.06

國家自然科學(xué)基金項目（81373598）。

丁偉偉（1987-），女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)藥防治呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)研究工作。

李澤庚，E-mail：li6609@126.com。

（2015-01-31）