張亞楠，陳劍松，黎惠柔，何建峰（廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

科技與應(yīng)用

基于硼酸酯黃酮苷分子印跡聚合物的制備及識(shí)別性能研究

張亞楠，陳劍松，黎惠柔，何建峰*
（廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

分別以蘆丁和柚皮苷為模板分子，4-乙烯基苯硼酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，1，4-二氧六烷為致孔劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，采用可逆共價(jià)結(jié)合方式制備出兩種基于硼酸酯結(jié)合的分子印跡聚合物，并對(duì)它們的吸附介質(zhì)、結(jié)合動(dòng)力學(xué)速率、專一識(shí)別性和交叉選擇性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，可逆共價(jià)印跡聚合物適用于水相介質(zhì)，在3 h內(nèi)可以達(dá)到吸附平衡。選擇性結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明該兩種MIP具有良好的分離選擇性，其對(duì)各自的模板分子均表現(xiàn)最大的吸附量，而對(duì)其結(jié)構(gòu)類似物吸附較少。

蘆丁；柚皮苷；分子印跡聚合物；硼酸酯

分子印跡是制備針對(duì)特定模板具有特異識(shí)別能力聚合物的技術(shù)，采用該技術(shù)制備的分子印跡聚合物（MIP）目前已廣泛應(yīng)用于固相萃?。?］、色譜分離［2］、化學(xué)傳感器［3］和藥物載體［4］等領(lǐng)域。傳統(tǒng)的MIP一般采用非共價(jià)印跡方法制備，一般在弱極性有機(jī)溶劑中使用，不適用于強(qiáng)極性有機(jī)溶劑和水相，因而限制了它的應(yīng)用。黃酮苷類化合物是中草藥中重要的活性成分，在醫(yī)藥中有許多重要的應(yīng)用，但黃酮苷化合物種類繁多，結(jié)構(gòu)相似，使得其分離較為困難。本研究以黃酮苷類化合物蘆丁和柚皮苷為印跡分子，4-乙烯基苯硼酸為功能單體，采用可逆共價(jià)結(jié)合方式制備出兩種基于硼酸酯結(jié)合的新型MIP，并對(duì)它們的吸附介質(zhì)、結(jié)合動(dòng)力學(xué)速率和專一選擇性進(jìn)行了探討，該研究對(duì)于開(kāi)發(fā)應(yīng)用黃酮苷類化合物的分離固相材料具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1　實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

柚皮苷、蘆?。?8%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；4-乙烯基苯硼酸（80%，阿法埃莎（天津）化學(xué)有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，98%，上海阿拉丁試劑有限公司，使用前經(jīng)過(guò)減壓蒸餾以除去阻聚劑）；偶氮二異丁腈（AIBN，化學(xué)純，廣州化學(xué)試劑廠，使用前重結(jié)晶）；1，4-二氧六烷（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；分子篩（AR，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；

UV-1000紫外分光光度計(jì)（上海天美科技有限公司）；KQ-50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蘆丁、柚皮苷分子印跡聚合物的制備

稱取蘆丁0.061 2 g，4-乙烯基苯硼酸0.029 2 g，溶于15 mL 1，4-二氧六烷中，滴加2滴濃硫酸，于94℃回流反應(yīng)1 h，得預(yù)聚體。將預(yù)聚體置于15 mL試管中，依次加入EDMA 0.091 0g，AIBN 0.011 0g，通氮?dú)?0 min，將試管密封，并置于65℃水浴中反應(yīng)36 h，得到白色塊狀聚合物。將聚合物研磨，過(guò)120目篩，獲得的聚合物微粒用20 mL甲醇-水（v/v，7∶3）在40℃下攪拌回流，每5 h更換一次溶劑，直至水解液經(jīng)紫外檢測(cè)無(wú)模板分子吸收為止，最后用甲醇將聚合物洗至中性。將制備的分子印跡聚合物在60℃下真空干燥24 h，備用。柚皮苷MIP制備時(shí)模板分子使用量為0.058 g，其它試劑用量與制備方法與蘆丁相同。

柚皮苷、蘆丁空白聚合物（NIP）的制備方法同上，但不加模板分子。

1.2.2印跡聚合物的底物選擇性研究

稱取10 mg蘆丁、柚皮苷的MIP/NIP置于錐形瓶中，分別加入2 mL 2 mmol/L各底物（蘆丁、柚皮苷、槲皮素）的甲醇-磷酸緩沖液（v/v，7∶3，pH= 8），于室溫下攪拌24 h，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，用紫外-可見(jiàn)光譜分析濾液中待測(cè)物的濃度，并計(jì)算出聚合物對(duì)模板分子的吸附量Q（μmol/g）。

1.2.3柚皮苷MIP的吸附動(dòng)力學(xué)研究

稱取10mg柚皮苷MIP置于錐形瓶中，分別加入2mL 2mmol/L柚皮苷的甲醇-磷酸緩沖液（v/v，7∶3， pH=8），于室溫下攪拌，分別于0.5 h、2 h、3 h、5 h、6 h、10 h取濾液進(jìn)行紫外光譜分析，檢測(cè)濾液中柚皮苷的濃度，并計(jì)算出聚合物對(duì)模板分子的吸附量Q（μmol/g）。

2　結(jié)果與討論

2.1聚合物的制備

圖1出示了柚皮苷分子印跡聚合物的制備示意圖。本研究根據(jù)柚皮苷、蘆丁糖單元含順式二醇的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選用4-乙烯基苯硼酸為功能單體，通過(guò)加熱回流反應(yīng)先使其與順式二醇形成環(huán)狀硼酸酯預(yù)聚體，然后再將預(yù)聚體通過(guò)交聯(lián)劑引發(fā)聚合形成高度交聯(lián)的高分子聚合物，用甲醇-稀鹽酸水解功能單體與模板分子形成的硼酸酯鍵，這樣在聚合物母體中得到分子印跡孔穴，此孔穴形狀與模板分子匹配，孔穴周圍的硼酸基能與模板分子可再次形成硼酸酯鍵，因而其對(duì)模板分子具有高度的識(shí)別能力。

圖1　柚皮苷可逆共價(jià)分子印跡聚合物制備示意圖

2.2吸附介質(zhì)的優(yōu)化

吸附介質(zhì)是影響MIP吸附性能的一個(gè)重要指標(biāo)。研究表明，以純有機(jī)溶劑甲醇和1，4-二氧六烷為吸附介質(zhì)，當(dāng)柚皮苷濃度為2 mmol/l時(shí)，MIP對(duì)模板分子的吸附量分別為6.71 μmol/g和17.00 μmol/g。而以甲醇-磷酸緩沖液（pH=7.0）（v/v，7∶3）作為吸附介質(zhì)時(shí)，吸附量明顯提高，可達(dá)34.80 μmol/g，表現(xiàn)出比單純有機(jī)介質(zhì)更好的吸附性。由于堿性條件更有利于硼酸酯鍵的形成［5］，故在該研究中，對(duì)MIP在不同pH值下的甲醇-磷酸緩沖液（v/v，7∶3）中的吸附效果進(jìn)行了進(jìn)一步的探討。結(jié)果如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，隨著吸附介質(zhì)pH值增大，MIP和NIP的吸附量逐漸增多，但NIP的增加量明顯比MIP要少，說(shuō)明pH值的升高對(duì)于特異性吸附影響較大。當(dāng)pH=8.0時(shí)，MIP和NIP吸附量分別達(dá)到64.8 μmol/g 和29.03 μmol/g，此時(shí)MIP吸附量較高，且MIP和NIP差異也相對(duì)最大，再增大吸附介質(zhì)的pH值實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此時(shí)柚皮苷不能完全溶解，因此本研究選取甲醇-磷酸緩沖液（pH=8.0）（v/v，7∶3）作為最佳的吸附介質(zhì)。

圖2　柚皮苷MIP/NIP在不同pH值條件下的吸附量

2.3柚皮苷的吸附動(dòng)力學(xué)研究

MIP對(duì)印跡分子的吸附平衡時(shí)間影響其色譜分離行為，為了研究MIP對(duì)模板分子的結(jié)合速率，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用2 mmol/l的柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)液的的甲醇-磷酸緩沖液 （v/v，7∶3）為吸附介質(zhì)，測(cè)定了MIP在pH8.0磷酸鹽緩沖液中對(duì)模板分子的吸附動(dòng)力學(xué)行為。由圖3可見(jiàn)，在pH 8.0時(shí)，MIP對(duì)模板分子的結(jié)合是較快的，其吸附量在60 min時(shí)可達(dá)到最大結(jié)合容量的63%，在3小時(shí)之內(nèi)可達(dá)到吸附平衡，這與非共價(jià)印跡聚合物的結(jié)合速率基本相似［6-7］。

圖3　柚皮苷MIP的動(dòng)力學(xué)吸附曲線

2.4印跡聚合物對(duì)底物的結(jié)合選擇性

聚合物對(duì)底物的結(jié)合分配系數(shù)可描述為Kd=CP/CS，式中CP（μmol/g）為底物在聚合物上的結(jié)合量；CS（mmol/l）為平衡吸附液中底物的濃度。Kd值越高，表示聚合物對(duì)該底物的結(jié)合量越大［8］。分別選取化合物蘆丁、柚皮苷和槲皮素作為聚合物底物，對(duì)其選擇性進(jìn)行探討，結(jié)果如表1、表2所示。

從表1、表2可以看出，蘆丁MIP對(duì)蘆丁的Kd值明顯比對(duì)柚皮苷和槲皮素要高，而柚皮苷MIP對(duì)柚皮苷的Kd值則明顯比槲皮素和蘆丁要高，而NIP對(duì)三種底物的吸附均比MIP低。這表明MIP對(duì)模板分子具有明顯的專一識(shí)別能力和高度選擇性。據(jù)此可推測(cè)印跡聚合物中產(chǎn)生了具有特異識(shí)別的分子印跡孔穴，雖然槲皮素和蘆丁含有鄰二醇結(jié)構(gòu)，可以形成硼酸酯，但是由于它們的分子形狀與模板分子差異較大，故其不能進(jìn)入分子印跡孔穴與硼酸基團(tuán)產(chǎn)生共價(jià)作用，因而柚皮苷MIP對(duì)底物槲皮素和蘆丁吸附均較少。

表1 蘆丁MIP/NIP 對(duì)各底物的Kd值

表2　柚皮苷MIP/NIP對(duì)各底物的Kd值

3　結(jié)論

本研究以蘆丁和柚皮苷為模板分子，4-乙烯基苯硼酸作為功能單體，采用可逆共價(jià)的結(jié)合方式分別制備蘆丁和柚皮苷分子印跡聚合物。研究結(jié)果表明，基于硼酸酯可逆共價(jià)結(jié)合的MIP具有在堿性水溶液中對(duì)模板分子相對(duì)較快的吸附動(dòng)力學(xué)以及較高的專一識(shí)別性能。作為固相萃取的新型吸附劑材料，該MIP顯示了良好的分離能力和在水相環(huán)境中的良好適應(yīng)能力，故在中藥有效成分黃酮苷類化合物的分離純化方面具有良好的應(yīng)用前景。

［1］HU X G，HU Y L，LI G K.Development of novel molecularly imprinted solid-phase microextraction fiber and its application for the determination of triazines in complicated samples coupled with high-performance liquid chroma-tography［J］.J.Chromatogr.A，2007，1147（1）：1-9.

［2］XIE J C，XU X J，et al.Direct extraction of specific pharmacophoric flavonoids from gingko leaves using a molecularly imprinted polymer for quercetin［J］.J.Chromatogr. A，2011，934（1/2）：1-11.

［3］衣麗娜，尹小英，江一帆，等.分子印跡技術(shù)高效分離中藥活性成分的應(yīng)用［J］.國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2012，39 （4）：307-310.

［4］孔丹鳳，趙雯，盧婷利，等.分子印跡技術(shù)在藥物分離中的研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2011，29（3）：161-164.

［5］姜忠義.分子印跡聚合物的設(shè)計(jì)與制備［J］.高分子材料科學(xué)與工程，2004，20（3）：25-28.

［6］XU l，XU Z F.Molecularly imprinted polymer based on multiwalled carbon nanotubes for ribavirin recognition ［J］.J.Polym.Res.，2012，19（8）：9942.

［7］徐莉，何健峰.親水性分子印跡納米球的合成及藥物識(shí)別與釋放性能研究［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，49（3）：61-64.

［8］ZHANG l Y，CHENG G X，F(xiàn)U C.Synthesis and characteristics of tyrosine imprinted beads via suspension polymerization［J］.ReactReact Funct Polym，2003，56（3）：167-171.

［責(zé)任編輯：吳卓］

The Preparation of Flavonoid Glycoside Molecularly Imprinted Polymer Based on Borate Ester and Its Recognition Properties

ZHANG Yanan，CHEN Jiansong，LI Huirou，HE Jianfeng*
（School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou Guangdong 510006，China）

In this study，two kinds of molecularly imprinted polymers based on borate ester were prepared by using rutin and naringin as template molecules，4-vinyl phenylboronic acid as functional monomer，two glycol methacrylate as cross-linking agent，1，4-dioxane as a porogenic agent，AIBN as initiator，respectively.The adsorption medium，binding kinetics，specific recognition and cross-selectivity of the imprinted polymers were studied.The results showed that the reversible covalent imprinted polymers were suitable for using in aqueous media，and it could reach the adsorption equilibrium in the 3 hours.The selective experiment indicated that both polymers showed the maximum adsorption for template molecule，while less for its analogues，which showed a good separative ability and selectivity.

rutin；naringin；molecularly imprinted polymer；borate ester

O631.3

A

1672-6138（2015）03-0007-04

10.3969/j.issn.1672-6138.2015.03.002

2015-06-09

廣東高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)項(xiàng)目（K5090006）。

張亞楠（1993—），女，河南許昌人，廣州中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向：高分子功能材料。