馬 玲，周 勇，王 莉，姚 華

(新疆醫(yī)科大學(xué)1.公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，新疆烏魯木齊830011;3.北京市東城區(qū)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)管理中心，北京100701;4.新疆醫(yī)科大學(xué)新疆重大疾病醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，新疆烏魯木齊830011)

隨著尿酸與心血管之間關(guān)系的深入研究，高尿酸血癥是否為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素的爭(zhēng)議不斷。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)尿酸可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)和功能障礙［1-2］。目前認(rèn)為高尿酸導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激有關(guān)。高尿酸血癥大鼠體內(nèi)的抗氧化能力下降［3］。α-硫辛酸 (Alpha-lipoic acid，α-LA)是線粒體酶系復(fù)合物的一種輔助因子，能夠抑制脂質(zhì)過氧化、清除氧自由基、恢復(fù)和增加體內(nèi)其他抗氧化劑水平，從而減弱氧化應(yīng)激、降低炎性標(biāo)志物水平和改善內(nèi)皮細(xì)胞功能［4］。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察α-硫辛酸對(duì)高尿酸血癥大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平和血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響，為進(jìn)行此類疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

酵母(97%)和β-actin(Sigma公司)，氧嗪酸鉀(OA)(OXOID公司)，α-LA(江蘇神龍藥業(yè)有限公司)，超氧歧化物酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)試劑盒(為南京建成生物工程研究所)，SOD一抗和二抗(Santa公司)，CAT一抗(Epitomics公司)，CAT二抗(北京中杉金橋公司)，BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±35)g［新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(新)2003-0004］。隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、α-LA低劑量組(LLA組)、α-LA中劑量組(MLA組)和α-LA高劑量組(HLA組)，每組12只。對(duì)照組給予普通飼料喂飼，模型組和α-LA干預(yù)組參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行高尿酸血癥大鼠造模，3周后在持續(xù)造模的基礎(chǔ)上，每天分別給予10、30和90 mg/kg的α-硫辛酸灌胃，連續(xù)2周。實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物自由攝食和飲水。

1.3 樣本收集與指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 樣本收集:干預(yù)2周后，烏拉坦腹腔麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，取胸主動(dòng)脈，0.9%氯化鈉溶液沖洗后，去近心端約1 cm，一段放入甲醛小瓶中固定，病理HE染色切片觀察、一段放入已編號(hào)的盛有2.5%戊二醛小瓶中固定，電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)，剩余部分－80℃保存?zhèn)溆玫鞍诇y(cè)定。

1.3.2 指標(biāo)檢測(cè):生化法檢測(cè)血清尿酸(UA)，試劑盒檢測(cè)血清SOD、GSH-Px、CAT和MDA水平。

1.3.3 Western blot:檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈SOD、CAT蛋白:RlPA提取細(xì)胞蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)所測(cè)得濃度調(diào)整上樣量，使每孔蛋白上樣量均為40 μg，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交和顯影，掃描片子后用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用軟件SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。多組之間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析;兩兩比較時(shí)，方差齊，進(jìn)行SNK檢驗(yàn)(Student-Newman-Keuls);方差不齊，進(jìn)行Games-Howell檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 α-LA干預(yù)前后各組大鼠血清尿酸水平比較

干預(yù)前，模型組和α-硫辛酸干預(yù)組的血清尿酸水平均高于對(duì)照組(P＜0.05);干預(yù)后，各劑量干預(yù)組血清尿酸水平低于模型組(P＜0.05)(表1)。

2.2 α-LA干預(yù)后各組大鼠血清抗氧化酶活力的比較

模型組的SOD、GSH-Px和CAT酶活力均低于對(duì)照組，MDA含量高于對(duì)照組(P＜0.05)。α-硫辛酸干預(yù)后，高、中和低劑量組MDA含量低于模型組，中劑量和高劑量組SOD酶活力高于模型組(P＜0.05)(表2)。

表1 各組大鼠α-LA干預(yù)前后的血清尿酸水平比較Table 1 Comparison of serum uric acid in hyperuricemia rats before and after intervention of α-lipoic acid(n=12± s，mmol/L)

表1 各組大鼠α-LA干預(yù)前后的血清尿酸水平比較Table 1 Comparison of serum uric acid in hyperuricemia rats before and after intervention of α-lipoic acid(n=12± s，mmol/L)

#P＜0.05 compared with control group;*P＜0.05 compared with model group．

group before intervention after intervention normal control 76.3±19.3* 65.0±23.3*model 127.4±18.0# 123.2±29.3#LLA 124.7±25.2# 59.5±29.5*MLA 123.5±24.2# 47.8±18.3*HLA 151.5±26.9# 31.7±21.3*

2.3 α-LA干預(yù)后各組大鼠胸主動(dòng)脈SOD、CAT蛋白表達(dá)

模型組的SOD和CAT蛋白表達(dá)水平均顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.05)(圖1，2)。

LLA、MLA、HLA組SOD吸光度值均高于模型組;MLA、HLA組CAT吸光度值均高于模型組(P＜0.05)(表3)。

圖1 各組大鼠胸主動(dòng)脈SOD蛋白表達(dá)水平Fig 1 SOD's protein expression of rat's thoracic aorta in different groups(Western blot)

圖2 各組大鼠胸主動(dòng)脈CAT蛋白表達(dá)水平Fig 2 CAT's protein expression of rat's thoracic aorta in different groups(Western blot)

2.4 α-LA干預(yù)后大鼠胸主動(dòng)脈的病理改變

正常對(duì)照組大鼠的胸主動(dòng)脈壁內(nèi)膜表面光滑、完整、各層結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密無脫落，少見炎性細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)。模型組可見大鼠部分內(nèi)皮細(xì)胞水腫、脫落，內(nèi)膜凸起;干預(yù)高劑量組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮水腫、凸起數(shù)量減少(圖3)。

2.5 干預(yù)后大鼠胸主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的改變

正常對(duì)照組:內(nèi)膜表面光滑，內(nèi)皮細(xì)胞多扁平，可見細(xì)胞核，染色質(zhì)較均勻。中膜彈性膜連續(xù)，層次清楚。平滑肌細(xì)胞單層排列，核多見。模型組:內(nèi)皮細(xì)胞水腫或脫落，細(xì)胞核基質(zhì)密度增大。內(nèi)彈力膜較厚，部分區(qū)域斷裂、缺失。平滑肌細(xì)胞層，寬窄不一，多見“多支性平滑肌細(xì)胞”，平滑肌細(xì)胞向腔內(nèi)移。線粒體腫脹，密度增大(圖4)。

LLA組:內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯，內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞下層連接不緊密，形成較大空泡。內(nèi)皮基質(zhì)密度較模型組有下降。細(xì)胞核異染色質(zhì)較多，線粒體較多。MLA組:內(nèi)皮細(xì)胞水腫程度較LLA組輕。中膜彈力層線粒體腫脹，數(shù)量增多。細(xì)胞核異染色質(zhì)較多，平滑肌細(xì)胞層不連續(xù)。HLA組:內(nèi)皮細(xì)胞水腫減輕，線粒體數(shù)量減少，內(nèi)彈力膜連續(xù)。平滑肌線粒體水腫減輕(圖5)。

表2 各組大鼠α-LA干預(yù)后血清SOD、GSH-Px、CAT和MDA的影響Table 2 Comparison of serum SOD，GSH-Px，CAT and MDA in hyperuricemia rats after the intervention of α-lipoic acid(n=12，mmol/L)

表2 各組大鼠α-LA干預(yù)后血清SOD、GSH-Px、CAT和MDA的影響Table 2 Comparison of serum SOD，GSH-Px，CAT and MDA in hyperuricemia rats after the intervention of α-lipoic acid(n=12，mmol/L)

#P＜0.05 compared with control group;*P＜0.05 compared with model group．

?

表3 各組大鼠α-LA干預(yù)后胸主動(dòng)脈SOD、CAT蛋白表達(dá)值Table 3 Comparison of expression of SOD and CAT protein in hyperuricemia rats after the intervention of α-lipoic acid(n=12±s)

表3 各組大鼠α-LA干預(yù)后胸主動(dòng)脈SOD、CAT蛋白表達(dá)值Table 3 Comparison of expression of SOD and CAT protein in hyperuricemia rats after the intervention of α-lipoic acid(n=12±s)

#P＜0.05compared with control group;*P＜0.05compared with model group．

group SOD CAT normal control 0.5378±0.0789* 0.5875±0.0441*model 0.2425±0.0464# 0.1952±0.0229#LLA 0.3278±0.0397#* 0.2448±0.0292#MLA 0.3727±0.0425#* 0.5728±0.0506*HLA 0.4249±0.0393#* 0.5966±0.0577*

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥大鼠進(jìn)行α-硫辛酸干預(yù)后，血清尿酸水平均顯著降低，提示α-硫辛酸干預(yù)有效。若延長(zhǎng)給藥時(shí)間，是否趨于穩(wěn)定，還有待進(jìn)一步研究。

血管內(nèi)皮功能紊亂涉及多種病理、生理機(jī)制，氧化應(yīng)激可能是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要機(jī)制之一［5］。當(dāng)血清尿酸水平＞380 μmol/L時(shí)，氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙［6］。本研究發(fā)現(xiàn)α-LA干預(yù)后，MDA含量降低，SOD活力升高，并且 SOD和CAT蛋白表達(dá)也顯著增高，提示α-LA增加抗氧化能力。但各組大鼠血清中CAT和GSH-Px活性無顯著性變化，可能由于灌胃給藥方法的首過效應(yīng)降低了α-LA的生物利用率，另外不排除由于樣本量所造成的第二類錯(cuò)誤。

研究報(bào)道尿酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂與線粒體損傷及細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生減少有關(guān)［7］。本研究通過光鏡未觀察到高尿酸血癥大鼠血管形態(tài)學(xué)的差異，但電鏡發(fā)現(xiàn)模型大鼠的胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞水腫或脫落，提示高尿酸血癥大鼠體內(nèi)抗氧化能力下降，出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷。為保證內(nèi)皮細(xì)胞正常功能，線粒體數(shù)目在早期出現(xiàn)代償性的增加，后由于α-LA干預(yù)，適度緩解了線粒體的氧化應(yīng)激損傷，使線粒體代償性增加的趨勢(shì)得到控制，線粒體數(shù)目先增加后減少，從而出現(xiàn)線粒體一過性增加。近年來關(guān)于高尿酸血癥血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的鮮有研究，本研究提示線粒體的改變對(duì)HUA的致病機(jī)制有重要意義。但此次實(shí)驗(yàn)未能對(duì)血管彈性以及血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，還需在今后的研究中予以補(bǔ)充。

圖3 光鏡下大鼠胸主動(dòng)脈病理改變Fig 3 Pathological alteration of rat's thoracic aorta nuder microscope(HE×400)

圖4 電鏡下大鼠胸主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)Fig 4 Ultrastruction of rat's thoracic aorta under electron microscope

圖5 電鏡下不同劑量的α-硫辛酸干預(yù)組的大鼠胸主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)Fig 5 Ultrastruction of rat's thoracic aorta under electron microscope in different groups ofα-lipoic acid intervention

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