徐 翔， 汪海濱， 孫中生， 周紹龍， 曾 立， 羅盛康

脂肪移植與研究

脂肪來(lái)源SVF聯(lián)合PRP注射改善鼻唇溝的臨床研究

徐 翔， 汪海濱， 孫中生， 周紹龍， 曾 立， 羅盛康

目的 觀察并分析富含血小板血漿(PRP)聯(lián)合血管基質(zhì)片段(SVF)治療面部鼻唇溝的有效性及安全性。 方法 對(duì)30 例鼻唇溝明顯的患者，從外周靜脈獲取血液，通過(guò)離心法獲得PRP；在患者大腿外側(cè)抽取脂肪，并通過(guò)酶解法獲取脂肪組織的SVF。按一定比例混合后，注射在鼻唇溝的真皮深層及皮下組織層。治療醫(yī)師依據(jù)皺紋評(píng)估分級(jí)(WAS)，對(duì)鼻唇溝進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估時(shí)間點(diǎn)為術(shù)前,術(shù)后即刻、7 d、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月。結(jié)果 所有患者的鼻唇溝都得到了較大程度的改善，注射過(guò)程中及術(shù)后未出現(xiàn)動(dòng)靜脈栓塞、注射區(qū)皮膚及組織壞死、感染、纖維化、組織變硬及形成腫塊等并發(fā)癥。術(shù)前WAS評(píng)分為3.30 ± 0.47，術(shù)后即刻、7 d、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月分別為1.22±0.54、0.69±0.45、0.98±0.55、1.18±0.64、1.23±0.72。其中，術(shù)后7 d的WAS評(píng)分下降程度最低，術(shù)后觀察點(diǎn)WAS評(píng)分與術(shù)前相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 結(jié)論P(yáng)RP聯(lián)合SVF療法，在不采用外源性填充材料的情況下，可以顯著改善中老年患者的鼻唇溝凹陷，有非常好的應(yīng)用前景。

血管基質(zhì)片段； 富血小板血漿； 鼻唇溝； 面部年輕化

自體脂肪移植由于取材豐富、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，成為自身軟組織缺損填充的研究熱點(diǎn)。有文獻(xiàn)證實(shí)，血管基質(zhì)片段(stromal vascular faction， SVF)中富含的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在脂肪移植后的恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著更為重要的作用[1-2]。此外，還有大量文獻(xiàn)證實(shí)，從人體血液中獲取的富血小板血漿(platelet rich plasma， PRP)，通過(guò)注射法植入體內(nèi)后,可以大量釋放細(xì)胞因子，如：PDGF、VEGF、TGF等，能夠刺激成纖維細(xì)胞的增殖及膠原成分的沉積[3-5]。因此，自2013年3月至2014年6月，我們基于細(xì)胞療法與細(xì)胞因子療法相結(jié)合對(duì)改善組織容量的考慮，將PRP與SVF混合后,注射于鼻唇溝真皮深層及皮下組織層，臨床效果滿意?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

本組共30例患者。男性8例，女性22例；年齡30～57歲，平均44歲。均為WAS評(píng)分[6]為3.0～4.0分的中、重度鼻唇溝患者，近6個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行任何鼻唇溝部位的處理和治療。局部無(wú)皮損或其他皮膚疾??；肝腎功能正常；無(wú)嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)病史和出血性疾病史。女性患者未處于妊娠或哺乳期。

2 方法

2.1 PRP的制備 用21 G蝶形采血針經(jīng)外周靜脈獲取血液9.0 ml，與1.5 ml抗凝枸櫞酸鹽溶液混合。采集血液在室溫下經(jīng)160 g離心10 min，離心后的血液分為3層，最上層為淡黃色血漿，最下層為紅細(xì)胞層，血小板主要聚集在上下兩層的交界區(qū),即中間層。將上清液和中間層轉(zhuǎn)移到另一試管內(nèi)進(jìn)行第2次離心，室溫下400 g離心10 min。離心完成后，上層不含血小板血漿，下層即PRP(血小板濃度>1×106/μl)。在整個(gè)操作過(guò)程中，血小板未被激活。

2.2 SVF的制備 采用腫脹抽脂技術(shù)，于大腿外側(cè)獲取10 ml純化脂肪，采用0.25%Ⅰ型膠原酶等量混合后，37 ℃消化30 min，期間每隔10 min進(jìn)行震蕩混勻處理，以使膠原酶和脂肪組織能夠充分接觸。消化完成后，采用200目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，過(guò)濾后，混懸液經(jīng)1200 g離心5 min，倒棄離心管上層液體，緊貼管壁下端液體,即為SVF細(xì)胞群。

2.3 注射方法 將獲得的2 ml PRP與SVF細(xì)胞群沉淀混合，分別用2支1 ml注射器進(jìn)行分裝。用1%利多卡因行雙側(cè)眶下神經(jīng)阻滯麻醉，采用27 G針頭按照線性注射方法，分別注入鼻唇溝真皮深層及皮下組織，針頭與皮膚表面成20°～30°。由鼻唇溝下方至上方，深層至淺層，呈厥葉狀注射(圖1)，直至鼻唇溝完全矯正，注射完成后給予局部冰敷20 min。注射過(guò)程無(wú)需矯枉過(guò)正，每側(cè)注射量均小于1 ml。

2.4 療效評(píng)價(jià) 治療醫(yī)師分別在術(shù)前，術(shù)后即刻、7 d、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月，依據(jù)WAS 對(duì)鼻唇溝進(jìn)行評(píng)估。

3 結(jié)果

本組共30例患者每側(cè)注射量為0.5～1.0ml,平均0.8ml。術(shù)后隨訪 6～9個(gè)月。注射完成后，鼻唇溝皺紋幾乎完全矯正，術(shù)后6個(gè)月效果仍然維持(圖2)；注射過(guò)程中未出現(xiàn)明顯的出血或血管栓塞等并發(fā)癥，1周內(nèi)治療區(qū)域輕微淤青完全消失，術(shù)后隨訪時(shí)未發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)節(jié)和其他不良反應(yīng)；術(shù)前WAS評(píng)分為3.30±0.47，術(shù)后即刻、7d、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月分別為1.22±0.54、0.69±0.45、0.98±0.55、1.18±0.64、1.23±0.72。其中,術(shù)后7dWAS評(píng)分下降程度最低，術(shù)后觀察點(diǎn)WAS評(píng)分與術(shù)前相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

4 討論

面部皮膚皺紋根據(jù)其分布位置可以分為額紋、眉間紋、魚尾紋、法令紋及木偶紋等。根據(jù)其發(fā)生機(jī)制可以分為動(dòng)態(tài)性皺紋及靜態(tài)性皺紋。動(dòng)態(tài)性皺紋的形成,主要是由于面部表情肌的過(guò)度活動(dòng)而在皮膚表面留下痕跡[7]，針對(duì)這類皺紋的處理，臨床上主要采用肉毒毒素進(jìn)行局部注射治療[8-9]。肉毒毒素是通過(guò)抑制神經(jīng)末梢內(nèi)部乙酰膽堿的釋放而達(dá)到廢用性肌肉萎縮，從而改善面部皺紋。靜態(tài)性皺紋的產(chǎn)生機(jī)制主要有以下3種[10]：⑴由于動(dòng)態(tài)性皺紋的長(zhǎng)期存在，引起膠原纖維的斷裂，從而導(dǎo)致皮膚表皮層及真皮層形成折痕；⑵隨著年齡的增長(zhǎng)，組織容量不斷丟失，局部組織容量的不足使得皺紋更為明顯[11]； ⑶由于長(zhǎng)期的重力作用，使面部軟組織整體下移。

圖1 鼻唇溝注射填充方法示意

Fig 1 Methods of injecting filling of nasolabial fold.

圖2 脂肪來(lái)源SVF聯(lián)合PRP注射改善鼻唇溝前后對(duì)比 a.術(shù)前 b.術(shù)后即刻 c.術(shù)后6個(gè)月

Fig 2 Comparison between preview and postview of nasolabial fold augmentation using a combined injection of platelet rich plasma and adipose-derived stromal vascular fraction. a.preview. b. postview at once. c.postview at 6 months.

中老年人群的鼻唇溝通常是由于局部組織容量的不足而導(dǎo)致面部外觀整體老態(tài)化。其治療以注射填充恢復(fù)容量為主，主要治療方法為注射可吸收真皮組織填充物。然而，所伴隨的缺點(diǎn)包括改善效果短暫、填充物的再吸收；另外，如果注射永久性填充材料，還伴有異體反應(yīng)，如包膜、肉芽腫形成，慢性或遲發(fā)型感染[12-13]。此外， 還有一些軟組織填充材料依賴于自身組織的纖維化反應(yīng)，達(dá)到容量擴(kuò)增的效果，這部分材料也主要是人工合成的非生物材料。相比較而言,由自身所獲得的軟組織填充物則是一個(gè)較為合適的選擇。

Azzena等[14]報(bào)道曾應(yīng)用自體脂肪結(jié)合PRP的方法治療凹陷性瘢痕；O′Connell等[15]還報(bào)道了65%的下肢靜脈潰瘍用PRP治療后，在16周內(nèi)可完全愈合。通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行低速離心產(chǎn)生富含血小板的血漿，富集后血漿中血小板濃度是全血中血小板濃度的60倍。這些血小板被證實(shí)其具有較高的生物活性，并且能在體外7 d內(nèi)持續(xù)釋放PDGF-BB、VEGF-A、TGF-b和IGF-1，這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞等的增殖。因此，我們認(rèn)為，在真皮內(nèi)或者真皮下層注射高濃度的血小板及生長(zhǎng)因子，可以產(chǎn)生更多的自體膠原，從而增加局部組織容量。

Kakudo等[16]將脂肪來(lái)源干細(xì)胞及真皮成纖維細(xì)胞與PRP或不含血小板血漿(platelet-poor plasma, PPP)混合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PRP相混合的脂肪來(lái)源干細(xì)胞比與PPP相混合的干細(xì)胞，其增殖活性明顯增加；而人真皮成纖維細(xì)胞的增殖活性也明顯增強(qiáng)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與5%的PRP混合后，人真皮成纖維細(xì)胞和脂肪來(lái)源干細(xì)胞在第7天的增殖活性達(dá)到最高。當(dāng)與更高或者更低濃度的PRP相混合時(shí)，效果則不明顯。 Choi等[17]發(fā)現(xiàn)，牙槽骨細(xì)胞在低濃度的PRP作用下增殖，但是在高濃度的PRP環(huán)境中，其增殖受到抑制。由此可知，為了達(dá)到最好的效果，生長(zhǎng)因子的最佳濃度也是非常重要的，并不是我們傳統(tǒng)所認(rèn)為的越高越好。

血小板內(nèi)的α顆粒包含許多細(xì)胞生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子在凝血酶或鈣離子的作用下，可被激活[18]。激活后，短時(shí)間內(nèi)將釋放大量的生長(zhǎng)因子，但這一過(guò)程是非持續(xù)性的。一些早期研究證實(shí)了與這一過(guò)程相關(guān)的組織學(xué)和臨床效應(yīng)，然而，這些效應(yīng)只發(fā)生在早期并且是短暫的。因此，這一過(guò)程的缺陷是缺乏更為持續(xù)的作用效果。有趣的是，Scherer等[19]發(fā)現(xiàn)，與凝血酶激活后的血小板相比較，未激活的血小板在促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面更具優(yōu)勢(shì)，因而傾向于將未激活的血小板用于細(xì)胞療法，而不是單純的存儲(chǔ)細(xì)胞因子。他們認(rèn)為，在未激活的狀態(tài)下，血小板能夠保持良好的功能活性，并持續(xù)緩慢的釋放細(xì)胞因子。因此，本研究中所使用的PRP提取物中，未添加氯化鈣或者凝血酶等血小板激活物。

在PRP輔助創(chuàng)面愈合或者組織容量的補(bǔ)充過(guò)程中，在具備細(xì)胞因子的情況下，還需要其他細(xì)胞成分的參與，尤其是具備分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞的參與，這些細(xì)胞成分能在相關(guān)細(xì)胞因子的作用下進(jìn)行增殖、分化。對(duì)這部分細(xì)胞成分進(jìn)行適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充，能夠更好地促進(jìn)我們的治療效果。SVF作為脂肪組織來(lái)源的混雜細(xì)胞群，包含富含CD34的間充質(zhì)干細(xì)胞，具備來(lái)源豐富，獲取簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[20]。因此，選擇SVF細(xì)胞群輔助鼻唇溝的軟組織擴(kuò)增，是十分有意義的。同時(shí)，本研究也是首次將PRP和SVF聯(lián)合治療鼻唇溝。

PRP聯(lián)合SVF療法的優(yōu)勢(shì)在于，在含有高濃度且可釋放細(xì)胞因子的血小板的同時(shí)，又含有高濃度具備分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞。相關(guān)研究證實(shí)，在真皮或真皮下注射生長(zhǎng)因子時(shí)，可刺激成纖維細(xì)胞的膠原沉積。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后7 d鼻唇溝的改善效果最佳，這可能與局部腫脹有關(guān)；7 d后改善效果開始減退；在術(shù)后1～6個(gè)月期間維持穩(wěn)定，但效果還是明顯優(yōu)于治療前。7 d后的表現(xiàn)可能是由于注射混合物的血清成分開始被吸收以及腫脹情況好轉(zhuǎn)所致。在后期細(xì)胞因子的作用下，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化為成纖維細(xì)胞，并分泌Ⅱ型膠原，從而維持鼻唇溝區(qū)域一定的組織容量。但是,其具體機(jī)制并不清楚，這是未來(lái)研究所要解決的問(wèn)題。本組患者在最長(zhǎng)9個(gè)月隨訪時(shí)間內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)鼻唇溝的再次復(fù)發(fā)；此外，在注射及隨訪過(guò)程中，未出現(xiàn)任何的不良反應(yīng)和并發(fā)癥，其治療的安全性也是可靠的。更為詳細(xì)、全面的治療結(jié)果需要在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上進(jìn)行觀察和討論。

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Improvementofnasolabialfoldbycombinedinjectionofplateletrichplasmaandadipose-derivedstromalvascularfraction

XUXiang,WANGHai-bin,SUNZhong-sheng,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,GuangdongSecondProvincialPeople′sHospital,Guangzhou510317,China)

Objective To observe the safety and efficacy of platelet rich plasma (PRP) and stromal vascular fraction (SVF) combined injection in correcting nasolabial folds. Methods Thirty female subjects with significant nasolabial folds were enrolled. Peripheral venous blood was obtained from each subject and was centrifuged to produce platelet rich plasma (PRP). Autologous fat was harvested from the lateral thighs of each subject to prepare the stromal vascular fraction (SVF) using enzymatic digestion. PRP and SVF were mixed proportionally, and the mixture was injected into the deep dermis and subcutaneous tissue of the nasolabial fold. The severities of nasolabial folds were evaluated by the treating surgeon using the wrinkles assessment scale (WAS) before the treatment, immediately after the treatment, at 7 days, 1 month, 3 months, and 6 months after the treatment. Results All subjects had significant nasolabial folds improvements. There were few complications, including vascular thrombosis, injection site skin or tissue necrosis, infection, fibrosis, tissue hardening or lumps, observed during and after the injection. Mean WAS scores immediately the treatment, at 1 week, 1 month, 3 months, and 6 months after treatment were 1.22±0.54, 0.69±0.45, 0.98±0.55, 1.18±0.64, 1.23±0.72 respectively, which were significantly lower than the score before the treatment (P<0.001). Conclusion The combined injection of PRP and SVF, without using any exogenous filler, can significantly improve the nasolabial depression of middle to elderly age patients. This technique may have good clinical applications in the future.

Stromal vascular fraction； Platelet rich plasma； Nasolabial fold； Facial rejuvenation

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(A2013130) 作者單位：510317 廣東 廣州，廣東省第二人民醫(yī)院 整形科 第一作者：徐 翔(1974-)，男，江西人，主治醫(yī)師. 通信作者：羅盛康，510317，廣東省第二人民醫(yī)院 整形科，電子信箱：luoshengkang63@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.02.003

R

A

1673-7040(2015)02-0072-04

2014-11-04)