范麗麗，李　楠，顧　星，朱　蘊(yùn)，劉志東，夏慶梅，郭麗麗，王愛(ài)潮（.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津30093；.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津30093）

UPLC法測(cè)定痤瘡凝膠中黃芩苷和蒙花苷的含量*

范麗麗1，李楠1，顧星1，朱蘊(yùn)1，劉志東1，夏慶梅2，郭麗麗1，王愛(ài)潮1
（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

［目的］建立痤瘡凝膠中黃芩苷、蒙花苷含量測(cè)定方法。［方法］采用Acquity BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱；以乙腈-0.1%甲酸（20∶80）為流動(dòng)相，流速0.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，柱溫35℃。［結(jié)果］黃芩苷和蒙花苷分別在3.767～75.34 μg和0.840 96～33.638 4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為99.04%和97.42%（n=6）；RSD分別為1.97%和1.81%。［結(jié)論］該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性良好，為痤瘡凝膠的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

痤瘡凝膠；黃芩苷；蒙花苷；超高效液相色譜法；含量測(cè)定

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.01.12

痤瘡是一種好發(fā)于青春期的毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病，治療不當(dāng)容易遺留瘢痕和色素沉著等損容性的皮膚損害，發(fā)病率較高［1-4］。痤瘡凝膠是天津中醫(yī)藥大學(xué)制劑中心研制的純中藥外用制劑，由黃芩、野菊花、丹參、白花蛇舌草、紅花、白薇、甘草等7味中藥組成，具有清熱涼血、活血消癰、散瘀止痛等功效［5-13］。實(shí)驗(yàn)已證明［14］，痤瘡凝膠對(duì)兔耳痤瘡模型有確切治療效果，且臨床用于尋常痤瘡的治療療效顯著。為了控制該制劑質(zhì)量，保證臨床用藥的安全有效，本研究采用超高效液相色譜法（UPLC法）對(duì)處方里黃芩中的黃芩苷和野菊花中的蒙花苷進(jìn)行了含量測(cè)定，為該方的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　儀器與試藥

超高效液相色譜儀（Waters，Acquity，TUV Detector，Sample Manager-FTN，Quaternary Solvent Manager美國(guó)），臺(tái)式通用冷凍離心機(jī)（THERMO FISHER美國(guó)），SZCL-4B磁力攪拌（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），C3860A超聲清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），AX205電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）。

黃芩苷（批號(hào)110715-201117）、蒙花苷（批號(hào)111528-201308），均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，痤瘡凝膠及陰性樣品均為課題組自制，甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件Waters ACQUITYUPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），乙腈-0.1%甲酸水（20∶80）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，流速0.3 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量1 μL。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于8 000。

2.2對(duì)照品溶液的制備取黃芩苷、蒙花苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含8.0 μg黃芩苷和1.5 μg蒙花苷的混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液及陰性樣品溶液的制備精密稱取本品1 g，至50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，14 000 r/min離心10 min，取上清液用去離子水稀釋5倍，過(guò)0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例及制備工藝制備缺黃芩和野菊花的陰性樣品，稱取相應(yīng)量，如上處理，得陰性樣品溶液。

2.4專屬性實(shí)驗(yàn)取黃芩苷、蒙花苷的混合對(duì)照品、痤瘡凝膠供試品和陰性樣品溶液，進(jìn)樣，結(jié)果陰性樣品無(wú)干擾，證明此色譜條件可行。見(jiàn)圖1。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密稱取黃芩苷、蒙花苷對(duì)照品適量，分別配成含黃芩苷0.935 3、2.338 4、4.676 7、9.353 4、14.030 1、18.706 8 μg/mL和蒙花苷0.346 2、0.865 4、1.730 8、3.461 6、5.192 5、6.923 3 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按色譜條件進(jìn)樣1 μL，測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸，黃芩苷回歸方程為：Y=8 755X-2 217，r2=0.999；蒙花苷回歸方程為：Y=7 681X-1 537，r2=0.998。結(jié)果表明黃芩苷和蒙花苷分別在3.767～75.34 μg和0.840 96～33.638 4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6精密度實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得黃芩苷和蒙花苷峰面積值的RSD分別為0.47%和0.89%，精密度符合要求。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)（140726）樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定分析，結(jié)果6份樣品中黃芩苷平均含量為1.99mg/g，RSD=1.54%；蒙花苷平均含量為0.37mg/g，RSD=1.34%。結(jié)果表明，重復(fù)性符合要求。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一供試品溶液分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，依法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果黃芩苷和蒙花苷峰面積的RSD分別為0.73%和1.19%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)（140726）樣品6份，各0.5 g，精密稱定，精密加入每1 mL含黃芩苷334.561 2 μg和蒙花苷65.809 2 μg的甲醇溶液3.0 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定樣品中黃芩苷和蒙花苷的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果黃芩苷和蒙花苷的平均回收率分別為99.04%和97.42%（n=6）；RSD分別為1.97%和1.81%。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1　痤瘡凝膠中黃芩苷、蒙花苷的UPLC色譜圖

表1　回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.10樣品測(cè)定取3批樣品（批號(hào)140724、140725、140726），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測(cè)定黃芩苷和蒙花苷的峰面積，結(jié)果黃芩苷的含量分別為1.901 0、1.909 5、1.878 4 mg/g；蒙花苷的含量分別為0.364 0、0.367 4、0.361 1 mg/g。

3　討論

3.1色譜條件根據(jù)黃芩苷和蒙花苷在200～600nm的紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，考察了波長(zhǎng)280、320、328和334 nm［15-17］時(shí)兩種成分的含量變化，最終選擇320 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，此時(shí)兩種成分含量均較高，且與雜峰分離較好。

考察了不同流動(dòng)相條件如甲醇-0.05%磷酸水，乙腈-0.1%磷酸水及乙腈-0.1%甲酸水等［18-21］，結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸水的峰形較好。又考察了此條件下流動(dòng)相的比例：乙腈-0.1%甲酸水（15∶85）、（18∶82）、（19∶81）、（20∶80）等，結(jié)果乙腈-0.1%甲酸水（20∶80）時(shí)黃芩苷和蒙花苷出峰時(shí)間適中，分離度高，峰形較好，與雜質(zhì)峰基線分離，且陰性樣品無(wú)干擾。

3.2提取溶劑實(shí)驗(yàn)中采用4種溶劑甲醇、純乙醇、75%乙醇、50%乙醇對(duì)供試品進(jìn)行超聲提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%乙醇、75%乙醇超聲提取完后過(guò)濾膜時(shí)很費(fèi)勁，無(wú)法過(guò)濾，并且蒙花苷溶解性不好，在甲醇中的溶解度最高，最終選擇甲醇為提取溶劑。

［1］夏慶梅，王泓午，徐麗敏．痤瘡中西醫(yī)研究進(jìn)展［J］．天津中醫(yī)藥，2011，28（1）：84-86．

［2］張靜文．痤瘡的研究進(jìn)展［D］．北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2007．

［3］張秀美，王秀蓮．痤瘡從濕熱論治探討［J］．天津中醫(yī)藥，2007，24（6）：521-522．

［4］鄧新煥，王亞靜，于悅，等.酚-黃復(fù)方對(duì)痤瘡致病菌的體外抗菌作用研究［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33（5）：299-302.

［5］官妍，謝萌，汪長(zhǎng)中，等.連翹苷和黃芩苷對(duì)表皮葡萄球菌生物膜抑制作用的研究［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22（10）：886-888.

［6］于悅，王亞靜，皮佳鑫，等.黃芩苷-冰片聯(lián)合應(yīng)用對(duì)表皮葡萄球菌的抑菌作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（10）：191-194.

［7］李秀玉．中藥白花蛇舌草在痤瘡治療中的應(yīng)用［J］．解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2011，36（12）：1376-1377．

［8］劉久利，何靜巖，趙文斌，等．中藥治療尋常痤瘡組方的文獻(xiàn)分析［J］．實(shí)用皮膚病學(xué)雜志，2013，6（1）：39-41．

［9］鄭璐璐，張貴君，王晶娟，等．野菊花藥效組分抗炎的生物效應(yīng)研究［J］．天津中醫(yī)藥，2011，28（3）：251-253．

［10］呂全興．丹參等中藥治療尋常痤瘡機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究［D］．濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2006．

［11］李秀玉，王曉靜．近6年來(lái)60首痤瘡專用方用藥規(guī)律探討［J］．中醫(yī)藥信息，2010，27（2）：36-38．

［12］華曉東，鞏媛媛，芮菁，等．黃芩素對(duì)皮膚過(guò)敏治療作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］．天津中醫(yī)藥，2007，24（3）：241-243．

［13］楊彥潔．中藥治療尋常性痤瘡的文獻(xiàn)分析及中醫(yī)藥內(nèi)外結(jié)合治療痤瘡的臨床研究［D］．北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2013．

［14］夏慶梅，景春暉，杜天樂(lè)．復(fù)方中藥痤瘡凝膠對(duì)兔耳痤瘡模型治療作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］．天津中醫(yī)藥，2014，31（5）：296-300．

［15］武昊昀，劉志東，李琳，等．pH敏感型黃芩苷眼用原位凝膠劑的體外研究［J］．中國(guó)新藥雜志，2011，20（6）：508-512．

［16］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)中國(guó)藥典一部［S］．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010．

［17］王伯濤，王鋒，張同波，等．反相高效液相色譜法測(cè)定野菊花中蒙花苷的含量［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（1）：166-168．

［18］周禮玲，張師愚．雙黃連滴丸質(zhì)量控制指標(biāo)黃芩苷的含量測(cè)定［J］．天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（4）：202-203．

［19］韓永成，龔海燕，劉偉，等．UPLC同時(shí)測(cè)定野菊花中蒙花苷和綠原酸含量［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（20）：88-90．

［20］陳紅英，倪健，張輝，等．HPLC測(cè)復(fù)方野菊花含片中黃芩苷和蒙花苷含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（10）：122-124．

［21］劉雪平．小兒清肺丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］．天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（1）：38-40．

Determination of Baicalin and Linarin in Cuochuang Gel by UPLC

FAN Li-li1，LI Nan1，GU Xing1，ZHU Yun1，LIU Zhi-dong1，XIA Qing-mei2，GUO Li-li1，WANG Ai-Chao1
（1.Tianjin Modern Chinese Medicine Key Laboratory-Province and Ministry Co-established State Key Laboratory Cultivation Base，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To establish a UPLC method for content determination of Baicalin and Linarin in Cuochuang Gel.［Methods］The column was Acquity BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）.The mobile phase consisted of a mixture acetonitrile-1%formic acid（20∶80）.The flow rate was 0.3 mL/min.The detection wavelength was 320 nm under 35℃.［Results］The calibration curves for baicalin and Linarin were linear in the ranges of 3.767～75.34 μg and 0.840 96～33.638 4 μg，and the average recovery was 99.04%and 97.42%（n=6），with RSD of 1.97%and 1.81%，respectively.［Conclusion］This method was simple，precise and repeatable，which can be used for quality control of Cuochuang Gel.

Cuochuang Gel；baicalin；Linarin；UPLC；content determination

R285.5

A

1673－9043（2015）01－0042-03

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（NCET-12-1068）。

范麗麗（1990-），女，碩士研究生，主要從事中藥制劑方向的研究。

劉志東，E-mail：lonerliuzd@163.com。

（2014-11-07）