吳楠，閔鶴鳴，屈惠瑩，包翠芬△

自噬基因pULK、PI3KC3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

吳楠1，閔鶴鳴2，屈惠瑩1，包翠芬2△

目的 探討自噬基因pULK、PI3KC3在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)及相關(guān)性。方法 隨機(jī)抽取NSCLC患者（肺癌組）77例（鱗癌31例、腺癌31例、大細(xì)胞未分化癌15例）及其癌旁正常組織21例作為對(duì)照。采用免疫組織化學(xué)染色及免疫印跡方法定性、定量檢測(cè)pULK、PI3KC3在NSCLC和癌旁正常肺組織中的表達(dá)情況，并采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行病理因素及相關(guān)性分析。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示pULK和PI3KC3陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)。pULK和PI3KC3在肺癌組中的陽性表達(dá)（35.1%、40.3%）顯著低于癌旁正常肺組織（81.0%、76.2%，P＜0.01）。NSCLC中無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的Ⅰ～Ⅱ期和中高分化患者的pULK和PI3KC3蛋白表達(dá)陽性率均較高（P＜0.01），而不同年齡、性別、腫瘤直徑大小的NSCLC的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析顯示pULK與PI3KC3表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論 pULK、PI3KC3在NSCLC中呈低表達(dá)。其表達(dá)與患者的臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者年齡、性別、腫瘤組織學(xué)類型及大小無關(guān)。

自噬；磷酸轉(zhuǎn)移酶類（醇族體）；癌，非小細(xì)胞肺；自噬相關(guān)蛋白1；Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌總數(shù)的80%，癥狀較隱匿，易復(fù)發(fā)，因此該病的預(yù)防和早期診斷尤為重要［1-2］。細(xì)胞自噬（autophagy）的形成與自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，Atg）有關(guān)［3-4］。目前關(guān)于肺癌中自噬相關(guān)蛋白1（autophagy related protein 1，pULK）、調(diào)控因子Ⅲ型磷脂酰肌醇 3激酶（phosphoinositide-3-kinase class 3，PI3KC3）的表達(dá)情況還不清楚。本研究通過檢測(cè)NSCLC標(biāo)本中自噬相關(guān)基因pULK、PI3KC3的表達(dá)情況，探討NSCLC中自噬相關(guān)基因的變化趨勢(shì)及可能的調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)抽取2013年1月—2014年10月遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的具有完整臨床及病理資料的NSCLC患者77例（肺癌組），所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。77例患者中，男39例，女38例，年齡36～74歲，平均（56±9）歲。所有病例均經(jīng)病理證實(shí)，術(shù)前未經(jīng)過放化療。按照國際抗癌聯(lián)盟2009年修訂的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期45例。按照WHO肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)：鱗癌31例，腺癌31例，大細(xì)胞未分化癌15例；中、高分化34例，低分化43例。瘤體直徑＜3 cm者47例，≥3 cm者30例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例。另收集部分患者距癌組織＞5 cm、經(jīng)HE染色證實(shí)無癌細(xì)胞浸潤的正常余肺組織21例（正常組）。所有標(biāo)本的使用均經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，取得患者或家屬的知情。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人pULK購自北京博奧森生物公司，PI3KC3單克隆抗體、normal rabbit IgG購自美國ABGENT公司。PV6001辣根酶標(biāo)記羊抗兔二抗試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。石蠟切片機(jī)、攤片烤片機(jī)（德國萊卡公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色及分析 手術(shù)切除后的標(biāo)本迅速經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，厚度5 μm切片。采用免疫組化Envision二步法進(jìn)行檢測(cè)。切片常規(guī)脫蠟至水，將切片置于含pH 6.0枸椽酸緩沖液的高壓鍋內(nèi)，加熱至減壓閥噴氣2 min以修復(fù)抗原，自然冷卻后，PBS洗滌；3%過氧化氫溶液處理10～30 min以去除內(nèi)源性過氧化物酶；滴加適當(dāng)濃度稀釋的一抗（兔抗人pULK抗體），4℃孵育過夜；滴加聚合物輔助劑，37℃孵育30 min；滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG多聚體（PV6001）37℃孵育30 min，以上各步驟間均采用0.01 mol/L PBS洗滌3次，每次5 min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。同型對(duì)照采用normal rabbit IgG替代一抗。PI3KC3蛋白染色步驟同上。

采用Greenspan半定量法對(duì)陽性細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽性細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度均分為1～4共4個(gè)級(jí)別，對(duì)應(yīng)的陽性細(xì)胞數(shù)量分別為≤10%、11%～25%、26%～50%、≥51%，對(duì)應(yīng)的染色強(qiáng)度分別為無著色、淡棕黃色、棕黃色、深棕色。兩者評(píng)分相乘，≤2分者為陰性，＞2分者為陽性。

1.3.2 免疫印跡 收集同期手術(shù)切除的肺癌組織和癌旁正常肺組織標(biāo)本，加入細(xì)胞裂解液，采用超聲粉碎儀進(jìn)行粉碎，離心取上清液。采用2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉法測(cè)定蛋白含量后，制備肺組織蛋白樣品。上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜、半干轉(zhuǎn)印，TBS-T漂洗后，采用5%血清白蛋白于室溫下封閉1～2 h。分別加入兔抗人pULK（1∶500稀釋）、PI3KC3（1∶1 000稀釋）抗體，于4℃層析冷柜內(nèi)震蕩孵育過夜，TBS-T液漂洗3次，每次約10 min；滴加1∶200稀釋的辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，室溫孵育1～2 h，TBS-T緩沖液漂洗3次，每次約10 min；然后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（Electro chemiluminescence，ECL）化學(xué)發(fā)光法顯色，內(nèi)參采用β-肌動(dòng)蛋白（β-Actin蛋白）進(jìn)行對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t法，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Bivariate（Spearman）等級(jí)相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 pULK和PI3KC3在肺癌和正常肺組織的表達(dá)情況

2.1.1 免疫組化結(jié)果 pULK和PI3KC3陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)。兩者在肺癌組的陽性表達(dá)率低于正常組（P＜0.01）。pULK和PI3KC3在鱗癌、腺癌、大細(xì)胞未分化癌中的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1，圖1、2。

Tab.1 Expression of pULK and PI3KC3 in human peri tumor normal lung tissue and non-small cell lung cancer表1 pULK、PI3KC3在癌旁正常肺組織與非小細(xì)胞肺癌表達(dá)的情況 例（%）

2.1.2 免疫印跡結(jié)果 pULK和PI3KC3在鱗癌、腺癌、大細(xì)胞未分化癌中的相對(duì)表達(dá)率低于正常組（P＜0.05），但NSCLC 3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2、圖3。

Tab.2 Comparison of expression levels of pULK and PI3KC3 in different types of NSCLC表2 pULK、PI3KC3在不同類型非小細(xì)胞肺癌表達(dá)水平比較 （%，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of pULK and PI3KC3 in different types of NSCLC表2 pULK、PI3KC3在不同類型非小細(xì)胞肺癌表達(dá)水平比較 （%，±s）

a與正常組比較P＜0.05

組別正常組鱗癌腺癌大細(xì)胞未分化癌F n5555 pULK 76.91±10.19 36.60±3.11a41.83±5.07a34.39±4.23a30.238＊＊PI3KC3 75.33±7.93 25.26±5.98a30.79±3.22a24.10±2.13a63.294＊＊

Fig.3 Comparison of expression levels of pULK and PI3KC3 in different types of NSCLC by Western blot圖3 pULK、PI3KC3在不同類型NSCLC表達(dá)情況比較條帶

2.2 不同臨床病理特征NSCLC患者中pULK和PI3KC3蛋白陽性表達(dá)的情況 NSCLC中無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的Ⅰ～Ⅱ期和中高分化患者的pULK和 PI3KC3蛋白表達(dá)陽性率均較高（P＜0.01），而不同年齡、性別、腫瘤直徑大小的NSCLC的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

Tab.3 Expression of pULK and PI3KC3 in different subgroups of NSCLC表3 pULK、PI3KC3在NSCLC中的表達(dá)情況例（%）

2.3 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NSCLC組織中，pULK與PI3KC3表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，見表4。

Tab.4 Correlation analysis of pULK and PI3KC3 in NSCLC表4 非小細(xì)胞肺癌中pULK、PI3KC3表達(dá)的相關(guān)性（例）

3 討論

自噬的形成分為誘導(dǎo)、啟動(dòng)、延長和成熟4個(gè)階段［5-6］。pULK主要參與自噬的誘導(dǎo)階段，其活性受到mTOR的調(diào)控；Atg6/Bclcin1主要參與自噬的起始階段。PI3KC3是Ⅲ型PI3K，即酵母Vsp34的同源蛋白，在進(jìn)化上非常保守，僅具有PI3K核心結(jié)構(gòu)，催化亞基Vsp34與Atg6/Bclcin1的保守結(jié)構(gòu)域（ECD）結(jié)合，催化質(zhì)膜的磷脂酰肌醇生成磷脂酰肌醇三磷酸，磷脂酰肌醇三磷酸募集含有其結(jié)合域的分子到細(xì)胞內(nèi)膜，并促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Atg21、Atg24等結(jié)合到膜上，形成自噬前體結(jié)構(gòu)（PAS）。而自噬的延伸階段主要由許多Atg因子調(diào)節(jié)參與［7-8］。一方面，Atg12與Atg5、Atg16形成復(fù)合體結(jié)合到PAS上；另一方面，Atg8/LC3分別在Atg7和Atg3兩種酶的作用下共價(jià)連接到磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）上形成LC3-Ⅱ-PE復(fù)合體，此復(fù)合體再結(jié)合到質(zhì)膜上參與PAS的延伸。最后，自噬體通過與溶酶體融合形成成熟的自噬體，即自噬溶酶體。在其作用下，自噬體膜及其包裹物發(fā)生降解［9］。

王文濤等［10］采取免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)72例NSCLC標(biāo)本中Beclin1、LC3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Beclin1在NSCLC的表達(dá)與患者的年齡及臨床分期有關(guān)，而LC3在NSCLC的表達(dá)與患者的臨床分期和腫瘤分化程度有關(guān)；且Beclin1、LC3在NSCLC中的表達(dá)呈正相關(guān)。此結(jié)果提示Beclin1、LC3在NSCLC中低表達(dá)，自噬活性的降低可能對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移起一定的作用。Cooper等［11-12］發(fā)現(xiàn)mTOR在NSCLC中的激活對(duì)NSCLC發(fā)生、發(fā)展中起到一定的作用，有望作為抗腫瘤治療的有效新靶點(diǎn)。

本研究在以上文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)肺癌中自噬誘導(dǎo)階段的主要因子pULK、起始階段的調(diào)控因子PI3KC3的表達(dá)情況。結(jié)果提示自噬活性的下降在 NSCLC的發(fā)生發(fā)展中可能起一定作用。NSCLC組織中的臨床病理因素分析顯示，pULK和PI3KC3蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤直徑大小無關(guān)。但在NSCLC早期，未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者是分化程度高的組織中呈現(xiàn)較高的表達(dá)趨勢(shì)，并且兩者表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)。pULK和PI3KC3的高表達(dá)提示肺癌自噬活性較高，推測(cè)NSCLC早期可能通過細(xì)胞自噬來發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生及發(fā)展的效應(yīng)。而在肺癌晚期，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或是分化程度較低時(shí)，pULK 和PI3KC3呈現(xiàn)表達(dá)減弱的趨勢(shì)，兩者在NSCLC中的表達(dá)減弱提示自噬活性的下降，并且可能與腫瘤發(fā)展和預(yù)后不良有關(guān)。目前，腫瘤自噬的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚，隨著研究的進(jìn)一步深入，必將明確其在NSCLC中發(fā)生、發(fā)展的作用，促進(jìn)NSCLC發(fā)生機(jī)制的闡明，為NSCLC的防治提供新策略，為新藥的開發(fā)提供可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

（圖1、2見插頁）

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（2014-08-26收稿 2015-01-09修回）

（本文編輯 魏杰）

Expression autophagy-related gene pULK and PI3KC3 and their correlation with human nonsmall-cell carcinoma

WU Nan1，MIN Heming2，QU Huiying1，BAO Cuifen2△
1 Department of Human Anatomy&Histology and Embryology，2 Key lab of Molecular Cell Biology and New Drug Development，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China
△Corresponding Author E-mail：mianyizuhua@aliyun.com

Objective To examine expression levels of autophagy gene pULK and PI3KC3 and to explore their correlation with non-small cell lung cancer（NSCLC）.Methods A total of 77 samples of surgical resection from NSCLC speci-mens（including 31 cases of squamous cell carcinoma，31 cases of adenocarcinoma and 15 cases of large cell undifferentiated carcinoma）and 21 samples of same normal lung tissue were randomly selected.Expressions of pULK and PI3KC3 in lung tissues were assessed by immunohistochemistry and Western blot.All dates were analyzed using SPSS13.0 statistical package.Results Immunohistochemistry indicated that pULK and PI3KC3 localized into the cytoplasm.The expression levels of pULK and PI3KC3 are significantly lower in patient with NSCLC than those in peri-tumor tissue（35.1%vs 81.0%，40.3% vs 76.2%respectively，P＜0.01）.Immunohistochemistry and Western bolt analysis confirmed that pULK and PI3KC3 expressions were significantly down-regulated（P＜0.01）in patients with low grade cellular differentiation，metastasis of lymph node，or stageⅢandⅣ.And expression levels of pULK and PI3KC3 in NSCLC did not differ significantly with ages，gender，tumor size and pathological type.Correlation analysis showed that the expression of PI3KC3 was positively correlated with pULK.Conclusion pULK and PI3KC3 expressions were lower in NSCLC than those in normal lung tissue group.The expression levels of pULK and PI3KC3 in NSCLC were correlated with patient's clinical stage，differentiation grade，lymph node metastasis but were unrelated with age，gender，histological type and size.

autophagy；phosphotransferases（alcohol group acceptor）；carcinoma，non-small-cell lung；autophagy related protein 1；phosphoinositide-3-kinase class 3

R734.2

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.015

遼寧省科技廳基金資助項(xiàng)目（201302143）

1錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室（郵編121000），2分子細(xì)胞生物與新藥開發(fā)省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

吳楠（1982），女，碩士在讀，主要從事肺癌發(fā)病機(jī)制方面研究

△E-mail：mianyizuhua@aliyun.com