張雪，田娟，趙越超，郭芳

GDNF及其受體GFRα1在小兒腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義

張雪1，2，田娟1△，趙越超1，2，郭芳1

目的 研究膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）及GDNF受體α1（GFRα1）在小兒腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)GDNF及其受體GFRα1在30例小兒腎母細(xì)胞瘤組織及16例瘤旁正常腎組織病理石蠟標(biāo)本中的表達(dá)。結(jié)果 GDNF在腎母細(xì)胞瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率高于瘤旁正常腎組織（66.7%vs 6.3%），GFRα1在腎母細(xì)胞瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率高于瘤旁正常腎組織（63.3%vs 6.3%）；兩者在上皮型和胚芽成分強(qiáng)烈表達(dá)，在間葉成分表達(dá)較弱。GDNF及其受體GFRα1在不同組織分型、臨床分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 腎母細(xì)胞瘤中GDNF及其受體GFRα1的高表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

腎母細(xì)胞瘤；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；GDNF受體α1；免疫組織化學(xué)

腎母細(xì)胞瘤是嬰幼兒時(shí)期最常見(jiàn)的腹部惡性實(shí)體腫瘤之一，由于其發(fā)生及調(diào)控機(jī)制尚不清楚，因而在臨床上難以得到有效防治及判斷預(yù)后。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成員，是目前發(fā)現(xiàn)的特異性最強(qiáng)的多巴胺能神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子［1］。GDNF受體alpha 1（GDNF family receptor alpha 1，GFRα1）是糖基化磷脂酰肌醇錨定受體，缺乏跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)，通過(guò)糖基化磷脂酰肌醇附著于細(xì)胞質(zhì)膜外層，與GDNF有高親和力，為其結(jié)合受體［2］。研究表明，GDNF及其受體GFRα1在腎臟發(fā)生發(fā)育中起重要作用，可通過(guò)其信號(hào)傳導(dǎo)通路參與輸尿管芽發(fā)生及分支［3-4］，且GDNF與腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生有關(guān)。本研究利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)GDNF及GFRα1在腎母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)，并觀察其與臨床病理特征之間的關(guān)系，為進(jìn)一步探討GDNF信號(hào)通路參與腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院2011年5月—2014年6月收治的腎母細(xì)胞瘤患兒30例，男16例，女14例，年齡5～108個(gè)月，左側(cè)19例，右側(cè)11例。按美國(guó)Wilms’瘤研究組（NWTS）臨床分期標(biāo)準(zhǔn)［5］：Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期8例，Ⅳ期8例。組織學(xué)類型：預(yù)后良好型（FH）20例，其中混合型12例，胚芽型4例，間質(zhì)型2例，上皮型2例；預(yù)后不良型（UH）又稱間變型10例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例。所有患兒術(shù)前均未行化療及免疫治療。

1.2 標(biāo)本處理 選取所有腎母細(xì)胞瘤組織，并從中任意抽取16例瘤旁正常腎組織作為對(duì)照組，組織距腫瘤≥3 cm，所有瘤旁腎組織經(jīng)病理證實(shí)鏡下存在正常腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)。所有標(biāo)本均采用4%多聚甲醛固定，常規(guī)乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，每例切取8張。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)GDNF和GFRα1的蛋白表達(dá)

1.3.1 主要試劑 GDNF兔多克隆抗體、GFRα1兔多克隆抗體購(gòu)自Santa公司。兔二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（PV-9001）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物工程有限公司。

1.3.2 染色步驟 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，高壓修復(fù)抗原2 min，入3%H2O2室溫孵育10 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，滴加GDNF或GFRα1兔多克隆抗體（工作液濃度1∶100），4℃過(guò)夜。滴加試劑1（聚合物輔助劑），37℃孵育30 min，滴加試劑2（辣根酶標(biāo)記抗兔IgG聚合物），37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封固，光鏡下觀察。上述各步驟均用0.01 mol/L PBS沖洗。采用陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.3 結(jié)果判定 細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野（×400）。根據(jù)著色深淺及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)判定：無(wú)陽(yáng)性染色為（-），細(xì)胞著色淺、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%為（+），著色較深、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～50%為（++），著色深、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%為（+++）。將-、+視為陰性表達(dá)，++、+++視為陽(yáng)性表達(dá)［6］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2或確切概率法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GDNF及GFRα1在腎母細(xì)胞瘤及瘤旁腎組織中的表達(dá) 腎母細(xì)胞瘤組織中，GDNF及其受體GFRα1在上皮型成分和胚芽成分呈彌散和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在間葉成分呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)，陽(yáng)性部位位于胞膜或胞質(zhì)。GDNF及其GFRα1在瘤旁腎組織微弱表達(dá)，其表達(dá)陽(yáng)性率低于腎母細(xì)胞瘤（P＜0.01），見(jiàn)圖1～6，表1。

2.2 GDNF及GFRα1與腎母細(xì)胞瘤臨床病理特征的關(guān)系 GDNF及GFRα1在不同組織分型程度、臨床分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組間表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

Tab.1 Comparison of GDNF and GFRα1 expression in nephroblastoma and peritumor renal tissue表1 GDNF及GFRα1在腎母細(xì)胞瘤和瘤旁腎組織的表達(dá)比較 例（%）

Tab.2 The relationship between expression levels of GDNF and GFRα1 in nephroblastoma with patient’s clinical pathological features表2 GDNF及其受體GFRα1與腎母細(xì)胞瘤臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

3 討論

腎母細(xì)胞瘤起源于未分化的后腎胚胎，是一種生長(zhǎng)迅速的實(shí)體惡性混合腫瘤，常見(jiàn)于兒童。其典型病變的腫瘤細(xì)胞成分具有三相性，包括胚基細(xì)胞、幼稚的上皮組織和間葉組織細(xì)胞［7］。腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未明確，目前被廣泛認(rèn)可的是“腎源性剩余”學(xué)說(shuō)［8］。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為某些個(gè)體腎組織中存在胚胎期腎組織，其可能是腎母細(xì)胞瘤的瘤前病變。目前國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因與腎母細(xì)胞瘤相關(guān)，包括有WT1、WT2、WTX、WT3、WT4（FWT1）、p53、p16、腫瘤黏連素分子基因等［9-10］，但尚未獲得確認(rèn)。GDNF/GFRα1信號(hào)傳導(dǎo)通路參與細(xì)胞增殖、分化、成熟和凋亡等過(guò)程。若其過(guò)度活動(dòng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖，甚者誘發(fā)腫瘤。近年來(lái)有研究表明，GDNF/ GFRα1信號(hào)傳導(dǎo)通路在腎臟發(fā)生發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，參與輸尿管芽的分化和增殖過(guò)程。同時(shí)有研究者發(fā)現(xiàn)，GDNF在腎母細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)［11-12］。本研究結(jié)果顯示，腎母細(xì)胞瘤組織中GDNF及其受體GFRα1的表達(dá)明顯高于瘤旁正常腎組織，說(shuō)明GDNF信號(hào)通路可能因過(guò)度活動(dòng)，導(dǎo)致后腎胚基細(xì)胞過(guò)度增殖，進(jìn)而誘發(fā)腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生，參與腎母細(xì)胞瘤的病理過(guò)程。但是，GDNF及其受體GFRα1的表達(dá)與腎母細(xì)胞瘤的組織分型、臨床分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性，說(shuō)明GDNF信號(hào)通路對(duì)腎母細(xì)胞瘤的病理進(jìn)展可能不起關(guān)鍵作用。腎母細(xì)胞瘤組織中，GDNF及其受體GFRα1在上皮型成分和胚芽成分呈彌散和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在間葉弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)，說(shuō)明在腎母細(xì)胞瘤發(fā)生過(guò)程中GDNF信號(hào)通路過(guò)度活動(dòng)主要促進(jìn)了上皮型和胚芽成分細(xì)胞的增殖，對(duì)間葉成分影響不大。

綜上所述，GDNF及其受體GFRα1的表達(dá)上調(diào)可能與腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生密切相關(guān)。但鑒于本研究樣本資料有限，GDNF信號(hào)通路在腎母細(xì)胞瘤中的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步的研究，檢測(cè)GDNF及其受體GFRα1蛋白異常表達(dá)有可能成為輔助診斷腎母細(xì)胞瘤的分子標(biāo)志。

（圖1～6見(jiàn)插頁(yè)）

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（2014-10-28收稿 2015-01-20修回）

（本文編輯閆娟）

The expression of GDNF and GFRα1 in childhood nephroblastoma and its clinical significance

ZHANG Xue1，2，TIAN Juan1△，ZHAO Yuechao1，2，GUO Fang1
1 Department of Histology and Embryology，Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China；2 Central Hospital of Fushun
Corresponding Author E-mail：tian555juan555@sina.com

Objective To investigate the expressions of GDNF and GFRα1 in childhood nephroblastoma，and therefore its clinical significance.Methods The expression levels of GDNF and GFRα1 were examined by immunohistochemistry of 30 parrafin samples from nephroblastoma section as well as 16 parrafin samples of peritumor renal tissue.Results The positive expression rate of GDNF and GFRα1 in nephroblastoma were higher than those in normal renal tissue（66.7%vs 6.3%；63.3%vs 6.3%）.GDNF and GFRα1 were strongly expressed in epithelium and embryo bud，but weakly expressed in lobus intermedius of nephroblastoma.There was no correlation between the expressions of GDNF and GFRα1 with histological types，clinical stage and metastasis of nephroblastoma of patients.Conclusion High expression of GDNF and GFRα1 in childhood nephroblastoma might indicate its role in tumor development.

nephroblastoma；glial cell line-derived neurotrophic factor；GDNF family receptor alpha 1；immunohistochemistry

R737.1

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.013

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2012307）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（2013022067）；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410160037）；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410160037）

1遼寧醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室（郵編121001）；2撫順市中心醫(yī)院

張雪（1982），女，碩士在讀，主要從事腎臟發(fā)育與腎腫瘤疾病研究

△E-mail：tian555juan555@sina.com