張雪，田娟，趙越超，郭芳

GDNF及其受體GFRα1在小兒腎母細胞瘤中的表達及意義

張雪1，2，田娟1△，趙越超1，2，郭芳1

目的 研究膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（GDNF）及GDNF受體α1（GFRα1）在小兒腎母細胞瘤中的表達及其臨床意義。方法 應用免疫組織化學法檢測GDNF及其受體GFRα1在30例小兒腎母細胞瘤組織及16例瘤旁正常腎組織病理石蠟標本中的表達。結果 GDNF在腎母細胞瘤中的陽性表達率高于瘤旁正常腎組織（66.7%vs 6.3%），GFRα1在腎母細胞瘤中的陽性表達率高于瘤旁正常腎組織（63.3%vs 6.3%）；兩者在上皮型和胚芽成分強烈表達，在間葉成分表達較弱。GDNF及其受體GFRα1在不同組織分型、臨床分期及有無淋巴結轉移的患者間表達差異無統(tǒng)計學意義。結論 腎母細胞瘤中GDNF及其受體GFRα1的高表達可能與腫瘤的發(fā)生密切相關。

腎母細胞瘤；膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子；GDNF受體α1；免疫組織化學

腎母細胞瘤是嬰幼兒時期最常見的腹部惡性實體腫瘤之一，由于其發(fā)生及調控機制尚不清楚，因而在臨床上難以得到有效防治及判斷預后。膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）屬于轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成員，是目前發(fā)現的特異性最強的多巴胺能神經元營養(yǎng)因子［1］。GDNF受體alpha 1（GDNF family receptor alpha 1，GFRα1）是糖基化磷脂酰肌醇錨定受體，缺乏跨膜區(qū)和膜內區(qū)，通過糖基化磷脂酰肌醇附著于細胞質膜外層，與GDNF有高親和力，為其結合受體［2］。研究表明，GDNF及其受體GFRα1在腎臟發(fā)生發(fā)育中起重要作用，可通過其信號傳導通路參與輸尿管芽發(fā)生及分支［3-4］，且GDNF與腎母細胞瘤的發(fā)生有關。本研究利用免疫組織化學法檢測GDNF及GFRα1在腎母細胞瘤組織中的表達，并觀察其與臨床病理特征之間的關系，為進一步探討GDNF信號通路參與腎母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的調控機制奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院2011年5月—2014年6月收治的腎母細胞瘤患兒30例，男16例，女14例，年齡5～108個月，左側19例，右側11例。按美國Wilms’瘤研究組（NWTS）臨床分期標準［5］：Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期8例，Ⅳ期8例。組織學類型：預后良好型（FH）20例，其中混合型12例，胚芽型4例，間質型2例，上皮型2例；預后不良型（UH）又稱間變型10例。有淋巴結轉移16例，無淋巴結轉移14例。所有患兒術前均未行化療及免疫治療。

1.2 標本處理 選取所有腎母細胞瘤組織，并從中任意抽取16例瘤旁正常腎組織作為對照組，組織距腫瘤≥3 cm，所有瘤旁腎組織經病理證實鏡下存在正常腎小球及腎小管結構。所有標本均采用4%多聚甲醛固定，常規(guī)乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，每例切取8張。

1.3 免疫組織化學染色方法檢測GDNF和GFRα1的蛋白表達

1.3.1 主要試劑 GDNF兔多克隆抗體、GFRα1兔多克隆抗體購自Santa公司。兔二步法免疫組化檢測試劑盒（PV-9001）、二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物工程有限公司。

1.3.2 染色步驟 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，高壓修復抗原2 min，入3%H2O2室溫孵育10 min以消除內源性過氧化物酶活性，滴加GDNF或GFRα1兔多克隆抗體（工作液濃度1∶100），4℃過夜。滴加試劑1（聚合物輔助劑），37℃孵育30 min，滴加試劑2（辣根酶標記抗兔IgG聚合物），37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封固，光鏡下觀察。上述各步驟均用0.01 mol/L PBS沖洗。采用陽性組織切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.3 結果判定 細胞質或細胞膜呈棕黃色或棕褐色為陽性細胞，隨機觀察5個高倍鏡視野（×400）。根據著色深淺及陽性細胞數判定：無陽性染色為（-），細胞著色淺、陽性細胞數＜25%為（+），著色較深、陽性細胞數25%～50%為（++），著色深、陽性細胞數＞50%為（+++）。將-、+視為陰性表達，++、+++視為陽性表達［6］。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對數據進行χ2或確切概率法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GDNF及GFRα1在腎母細胞瘤及瘤旁腎組織中的表達 腎母細胞瘤組織中，GDNF及其受體GFRα1在上皮型成分和胚芽成分呈彌散和強陽性表達，在間葉成分呈弱陽性或陰性表達，陽性部位位于胞膜或胞質。GDNF及其GFRα1在瘤旁腎組織微弱表達，其表達陽性率低于腎母細胞瘤（P＜0.01），見圖1～6，表1。

2.2 GDNF及GFRα1與腎母細胞瘤臨床病理特征的關系 GDNF及GFRα1在不同組織分型程度、臨床分期及有無淋巴結轉移分組間表達差異均無統(tǒng)計學意義，見表2。

Tab.1 Comparison of GDNF and GFRα1 expression in nephroblastoma and peritumor renal tissue表1 GDNF及GFRα1在腎母細胞瘤和瘤旁腎組織的表達比較 例（%）

Tab.2 The relationship between expression levels of GDNF and GFRα1 in nephroblastoma with patient’s clinical pathological features表2 GDNF及其受體GFRα1與腎母細胞瘤臨床病理特征的關系 例（%）

3 討論

腎母細胞瘤起源于未分化的后腎胚胎，是一種生長迅速的實體惡性混合腫瘤，常見于兒童。其典型病變的腫瘤細胞成分具有三相性，包括胚基細胞、幼稚的上皮組織和間葉組織細胞［7］。腎母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制尚未明確，目前被廣泛認可的是“腎源性剩余”學說［8］。該學說認為某些個體腎組織中存在胚胎期腎組織，其可能是腎母細胞瘤的瘤前病變。目前國內外研究發(fā)現多個基因與腎母細胞瘤相關，包括有WT1、WT2、WTX、WT3、WT4（FWT1）、p53、p16、腫瘤黏連素分子基因等［9-10］，但尚未獲得確認。GDNF/GFRα1信號傳導通路參與細胞增殖、分化、成熟和凋亡等過程。若其過度活動會導致細胞增殖，甚者誘發(fā)腫瘤。近年來有研究表明，GDNF/ GFRα1信號傳導通路在腎臟發(fā)生發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，參與輸尿管芽的分化和增殖過程。同時有研究者發(fā)現，GDNF在腎母細胞瘤組織中高表達［11-12］。本研究結果顯示，腎母細胞瘤組織中GDNF及其受體GFRα1的表達明顯高于瘤旁正常腎組織，說明GDNF信號通路可能因過度活動，導致后腎胚基細胞過度增殖，進而誘發(fā)腎母細胞瘤的發(fā)生，參與腎母細胞瘤的病理過程。但是，GDNF及其受體GFRα1的表達與腎母細胞瘤的組織分型、臨床分期及有無淋巴結轉移無明顯相關性，說明GDNF信號通路對腎母細胞瘤的病理進展可能不起關鍵作用。腎母細胞瘤組織中，GDNF及其受體GFRα1在上皮型成分和胚芽成分呈彌散和強陽性表達，在間葉弱陽性或陰性表達，說明在腎母細胞瘤發(fā)生過程中GDNF信號通路過度活動主要促進了上皮型和胚芽成分細胞的增殖，對間葉成分影響不大。

綜上所述，GDNF及其受體GFRα1的表達上調可能與腎母細胞瘤的發(fā)生密切相關。但鑒于本研究樣本資料有限，GDNF信號通路在腎母細胞瘤中的調控機制還需進一步的研究，檢測GDNF及其受體GFRα1蛋白異常表達有可能成為輔助診斷腎母細胞瘤的分子標志。

（圖1～6見插頁）

［1］Lin LF，Doherty DH，Lile JD，et al.GDNF:a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons［J］.Science，1993，260（5111）:1130-1132.

［2］Drawbridge J，Meighan CM，Mitchell EA.GDNF and GFRalpha-1 are components of the axolotl pronephric duct guidance system［J］.Dev Biol，2000，228（1）:116-124.

［3］Costantini F.GDNF/Ret signaling and renal branching morphogenesis:From mesenchymal signals to epithelial cell behaviors［J］.Organogenesis，2010，6（4）:252-262.

［4］Shakya R，Watanabe T，Costantini F.The role of GDNF/Ret signaling in ureteric bud cell fate and branching morphogenesis［J］.Dev Cell，2005，8（1）:65-74.

［5］Gao JC，Wang YP.Modern pediatric oncology［M］.Shanghai:Fudan University Press，2003:524-529.［高解春，王耀平.現代小兒腫瘤學［M］.上海:復旦大學出版社，2003:524-529］.

［6］Jiang Z，Sun YF，Huang XF，et al.The expression and significance of survivin protein in Nephroblastoma［J］.Shandong Medical Journa，2006，46（10）:16-17.［姜忠，孫永峰，黃緒峰，等.Survivin蛋白在腎母細胞瘤的表達及意義［J］.山東醫(yī)藥，2006，46（10）:16-17］.

［7］Tian F，Yourek G，Shi X，et al.The development of Wilms tumor: from WT1 and microRNA to animal models［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1846（1）:180-187.

［8］Al-Hussain T，Ali A，Akhtar M.Wilms tumor:an update［J］.Adv Anat Pathol，2014，21（3）:166-173.

［9］Zitzmann F，Mayr D，Berger M，et al.Frequent hypermethylation of a CTCF binding site influences Wilms tumor 1 expression in Wilms tumors［J］.Oncol Rep，2014，31（4）:1871-1876.

［10］Franken J，Lerut E，Van Poppel H，et al.p53 immunohistochemistry expression in Wilms tumor:a prognostic tool in the detection of tumor aggressiveness［J］.J Urol，2013，189（2）:664-670.

［11］Séguier-Lipszyc E，El-Ghoneimi A，Brinon C，et al.GDNF expression in Wilms tumor［J］.J Urol，2001，165（6）:2269-2273.

［12］Camassei FD，Boldrini R，Jenkner A，et al.Expression of glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin in mature kidney，nephrogenic rests，and nephroblastoma:possible role as differentiating factors［J］.Pediatr Dev Pathol，2003，6（6）:511-519.

（2014-10-28收稿 2015-01-20修回）

（本文編輯閆娟）

The expression of GDNF and GFRα1 in childhood nephroblastoma and its clinical significance

ZHANG Xue1，2，TIAN Juan1△，ZHAO Yuechao1，2，GUO Fang1
1 Department of Histology and Embryology，Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China；2 Central Hospital of Fushun
Corresponding Author E-mail：tian555juan555@sina.com

Objective To investigate the expressions of GDNF and GFRα1 in childhood nephroblastoma，and therefore its clinical significance.Methods The expression levels of GDNF and GFRα1 were examined by immunohistochemistry of 30 parrafin samples from nephroblastoma section as well as 16 parrafin samples of peritumor renal tissue.Results The positive expression rate of GDNF and GFRα1 in nephroblastoma were higher than those in normal renal tissue（66.7%vs 6.3%；63.3%vs 6.3%）.GDNF and GFRα1 were strongly expressed in epithelium and embryo bud，but weakly expressed in lobus intermedius of nephroblastoma.There was no correlation between the expressions of GDNF and GFRα1 with histological types，clinical stage and metastasis of nephroblastoma of patients.Conclusion High expression of GDNF and GFRα1 in childhood nephroblastoma might indicate its role in tumor development.

nephroblastoma；glial cell line-derived neurotrophic factor；GDNF family receptor alpha 1；immunohistochemistry

R737.1

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.013

遼寧省教育廳科學研究一般項目（L2012307）；遼寧省科學技術計劃項目（2013022067）；遼寧省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201410160037）；國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201410160037）

1遼寧醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室（郵編121001）；2撫順市中心醫(yī)院

張雪（1982），女，碩士在讀，主要從事腎臟發(fā)育與腎腫瘤疾病研究

△E-mail：tian555juan555@sina.com