王順義，李輝，胡長清，任東良，馬偉松，李偉鋒，于濤

年齡對骨折愈合影響的生物信息學分析

王順義，李輝，胡長清，任東良，馬偉松，李偉鋒，于濤

目的 探索年齡對骨折愈合速度的影響，并尋找在年齡對骨折愈合速度產(chǎn)生影響的過程中起重要作用的基因和通路。方法 利用R編程語言，分別找到在各時間點（未骨折，骨折后3 d、1周、2周、4周和6周）26周齡大鼠和52周齡大鼠相對于6周齡大鼠的差異表達基因，通過比較這12組差異表達基因，找到能夠使年齡對骨折愈合產(chǎn)生影響的基因，利用DAVID數(shù)據(jù)庫對這些基因進行功能注釋，并通過STRING數(shù)據(jù)庫構建這些基因的PPI網(wǎng)絡。結果 未骨折、骨折后2周、4周、6周，52周齡大鼠的差異表達基因均多于26周齡大鼠；骨折后6周，26周齡大鼠只有4個差異表達基因，而52周齡大鼠中有99個。這99個差異表達基因主要富集于與骨骼生長、免疫和炎癥等相關的生物過程，富集的KEGG通路有2條：ECM-receptor interaction和Arachidonic acid metabolism。Pcna、Casp3 和Fn1等在PPI網(wǎng)絡中與其他基因聯(lián)系較密切。結論 Pcna、Casp3和Fn1等基因可能在骨折愈合中起重要作用，其可能通過影響ECM-receptor interaction和Arachidonic acid metabolism等通路來發(fā)揮作用。

計算生物學；骨折；年齡因素；R編程語言；通路；PPI網(wǎng)絡

骨折是指骨結構的連續(xù)性完全或部分斷裂，多見于兒童及老年人。由于老年人身體各方面功能下降，導致其對于意外傷害造成骨折等危險因素的易感性明顯增加，此外老年人骨量明顯減少、骨的微觀結構退化以及增齡性骨質(zhì)疏松等原因，其在外力的作用下更易產(chǎn)生骨折［1］。在影響骨折后愈合的多種因素中，年齡是一個不可忽視的全身性因素，且多數(shù)老年人在骨折前已患有骨質(zhì)疏松，在骨折后，又進一步加劇了骨折愈合的難度，隨著年齡的增加，患者骨折愈合所需時間、愈合程度以及成功愈合的難度等亦隨之增加［2-3］。骨折愈合是一個極其復雜的生物學過程，受諸多因素的影響。Giannoudis等［4］提出骨折治療的“鉆石概念”（diamond concept），認為生長因子、骨傳導支架、間充質(zhì)干細胞以及機械環(huán)境是影響骨折愈合的4個主要因素。然而，老年人這一群體具有一定的特殊性，怎樣促進老年人的骨折愈合，一直是骨傷科領域的重點課題之一。本研究利用公共基因芯片數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）的芯片數(shù)據(jù)，對早期和晚期骨折患者的基因表達譜進行分析，重點對年齡偏大的大鼠在未骨折及骨折后各個時間點相對于年輕的大鼠差異表達基因進行比較，進一步探討年齡與骨折愈合之間的關系，旨在為老年人骨折治療提供新的指導思路。

1 材料與方法

1.1 表達譜芯片 表達譜芯片數(shù)據(jù)是在美國國家生物技術中心（NCBI）的GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫中下載的編號為GSE594［5］的芯片數(shù)據(jù)，物種類型為大鼠，疾病和組織類型分別為骨折和股骨。該芯片數(shù)據(jù)包含54個樣本：6周、26周和52周齡大鼠，在未骨折、骨折后3 d、1周、2周、4周和6周的樣本分別有3個。該芯片數(shù)據(jù)基于GPL85 ［RG_U34A］Affymetrix Rat Genome U34 Array平臺進行檢測。本研究的流程圖見圖1。

Fig.1 The workflow of our study圖1 本研究的流程圖

1.2 芯片數(shù)據(jù)預處理 利用R語言的affy［6］包，進行背景校準和樣本間的片間標準化，affy包進行標準化時默認的方法是 RMA；利用芯片平臺的注釋包（pd.rg.u34a，rgu34a.db，rgu34acdf，rgu34aprobe），把芯片上的探針符號轉化為基因符號，去掉沒有對應基因符號的探針，對于多個探針對應同一個基因符號的情況，取這些探針上表達值的平均值作為基因的表達值。

1.3 差異表達基因的篩選 利用R語言的limma［7］包，對芯片上檢測到的所有基因在實驗組和對照組之間的表達值進行t檢驗，并且經(jīng)過Bonferroni校正，選擇那些校正P＜0.05，并且log2（fold change）＞1的基因作為實驗組相對于對照組的差異表達基因。本研究得到12組差異表達基因：在各個時間點（未骨折、骨折后3 d、1周、2周、4周和6周），26周和52周齡大鼠相對于6周齡大鼠的差異表達基因。

1.4 差異表達基因的功能注釋 根據(jù)各組基因的數(shù)目及重合的基因找到在年齡影響骨折愈合中起重要作用的一組基因。利用DAVID［8］（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）在線工具，對這組基因進行功能注釋。選擇那些經(jīng)過Benjamini校正后P＜0.05，并且至少富集了10個基因的GO terms以及經(jīng)過Benjamini校正后P＜0.05的KEGG通路作為基因的主要富集功能。

1.5 差異表達基因PPI網(wǎng)絡的構建 絕大多數(shù)的疾病都是由基因之間的相互作用引起的，而不是由單個基因引起。為了在系統(tǒng)水平上探究基因怎樣使年齡對骨折的愈合產(chǎn)生影響，利用STRING［9］（http://www.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫構建了差異表達基因的PPI網(wǎng)絡，選擇的閾值是STRING中的默認值（綜合得分≥0.4）。利用Cytoscape［10］軟件對PPI網(wǎng)絡進行了可視化，并通過求PPI網(wǎng)絡中每個基因的節(jié)點度，即在PPI網(wǎng)絡中與該基因有直接相互作用的基因個數(shù)，找到PPI網(wǎng)絡中與其他基因聯(lián)系較密切的基因，這些基因有可能在年齡對骨折產(chǎn)生影響的過程中起著較重要的作用。

2 結果

2.1 芯片數(shù)據(jù)預處理 各個箱型中的黑線基本上在同一水平線上，說明標準化效果較好，可以用于后續(xù)分析，見圖2。在預處理前，芯片上總的有8 799個探針符號，經(jīng)過去除沒有對應基因符號的探針和對多個探針對應同一個基因符號的情況歸一化處理后，還剩下5 100個沒有重復的基因符號。

2.2 差異表達基因 6個時間點中有4個時間點（未骨折，骨折后2周、4周、6周）52周齡大鼠的差異表達基因均多于26周齡大鼠；骨折后6周，26周齡大鼠只有4個差異表達基因，而52周齡大鼠中有99個差異表達基因，后續(xù)對這99個差異表達基因展開分析。見圖3。

Fig.3 The different expressed genes of 26 week old rat and 52 week old rats compared with 6 week old rats in every time point圖3 各個時間點26周和52周齡大鼠相對于6周齡大鼠的差異表達基因

2.3 差異表達基因的功能注釋 富集的GO terms 有10條，包含defense response、response to bacterium、calcium ion binding等與骨骼愈合、炎癥以及免疫有關的生物過程，見表1。富集的KEGG通路有2條：ECM-receptor interaction和 Arachidonic acid metabolism。

Tab.1 Enriched GO terms of different expressed genes表1 差異表達基因富集的GO terms

2.4 差異表達基因的PPI網(wǎng)絡 差異表達基因的PPI網(wǎng)絡見圖4。Fn1與其他基因有著較密切的聯(lián)系（較大的節(jié)點度，即網(wǎng)絡中有較多的與它有直接相互作用的基因），Tnf、Syk和Casp3等基因也有較大的節(jié)點度。網(wǎng)絡中每個基因的節(jié)點度見表2。

Fig.4 The PPI network of the different expressed genes圖4 差異表達基因的PPI網(wǎng)絡

3 討論

骨折是生活中最常見的疾病之一，在各年齡段都有較高的發(fā)病率［11］。骨折的愈合是患者最關注的問題之一，并且愈合速度與多因素有關。Claes等［12］證實炎癥是影響骨折愈合速度的重要因素，且骨折部位固定的穩(wěn)定性以及愈合部位血液的供應也是很重要的因素。本研究通過分析GEO公共數(shù)據(jù)庫中關于骨折研究的大鼠mRNA表達譜數(shù)據(jù)，探究年齡對骨折愈合速度的影響，并且找到了在年齡對骨折愈合產(chǎn)生影響的過程中起重要作用的分子靶標及通路。與原始數(shù)據(jù)提供者的研究相比，本研究側重于對年齡偏大的大鼠在未骨折及骨折后各時間點較年輕大鼠差異表達基因的比較，并且找到可能使年齡對骨折愈合速度產(chǎn)生影響的一組基因；而原始研究則分別分析了不同年齡大鼠在骨折后各時間點較未骨折大鼠基因表達譜的變化，以及不同骨折部位（如股骨、股骨干骨痂等）基因表達譜的變化。此外，筆者通過構建差異表達基因的PPI網(wǎng)絡及對PPI網(wǎng)絡的分析，篩選得到了可能在年齡影響骨折愈合過程中發(fā)揮作用的靶基因。

Tab.2 The degree of every gene in the PPI network表2 PPI網(wǎng)絡中每個基因的節(jié)點度

多個研究指出年齡是影響骨折愈合的重要因素［13-14］。本研究結果顯示，骨折后3 d、1周、2周和4周，26周齡大鼠和52周齡大鼠相對于6周齡大鼠的差異表達基因的數(shù)目差別都不是很大，但是在骨折后6周，26周齡大鼠只有4個差異表達基因，而52周齡大鼠有99個，提示隨著年齡的增加，骨量減少，骨折愈合速度變慢。這99個基因可能是年齡對骨折速度產(chǎn)生影響的一個重要表現(xiàn)。經(jīng)功能富集分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達基因主要富集于defense response、response to bacterium、calcium ion binding等與骨骼愈合、免疫和炎癥等生物過程相關的功能中。Li等［15］研究指出，隨著骨折愈合過程的進行，血清中鈣離子的濃度會發(fā)生變化。提示這些差異表達基因所富集的功能，大部分都會參與骨折的愈合過程。另外，本研究得到ECM-receptor interaction和Arachidonic acid metabolism兩條差異表達基因富集的通路；Wang等［16］研究表明ECM-receptor interaction通路是骨折愈合過程與年齡相關的重要的潛在通路；Lin等［17］研究指出Arachidonic acid metabolism能夠調(diào)節(jié)骨折的愈合，與本研究結果一致。提示這兩條通路在骨折愈合的過程中可能起重要調(diào)控作用。

本研究中Fn1、Pcna和Casp3等在PPI網(wǎng)絡中與其他基因聯(lián)系較為密切。Casp3蛋白是一種半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，而半胱氨酸蛋白酶主要在破骨細胞中表達，能降低脫鈣骨基質(zhì)，影響骨骼的愈合速度［18］。Wu等［19］研究證實Casp3表達與應力性骨折的發(fā)生相關。Pcna蛋白是一種細胞周期蛋白，與DNA損傷和細胞增殖密切相關，Wang等［20］研究指出Pcna等基因是重要的成骨增長標志物，能影響骨折的愈合過程。提示PPI網(wǎng)絡中，這些與其他基因有密切聯(lián)系的基因節(jié)點有可能是影響骨折愈合速度的重要分子靶點，且其在不同年齡的大鼠股骨細胞中差異表達，從而使年齡對骨折的愈合速度產(chǎn)生影響。

通過本次分析，筆者初步推斷了年齡對骨折愈合速度所產(chǎn)生的影響，并且找到了能夠使年齡對骨折愈合速度產(chǎn)生影響的重要的分子靶標和通路。但是，生物信息學的方法僅是提供一定的方向性指導，要確定這些分子靶點是否真的與骨折的愈合速度有關，尚需分子生物學實驗進一步證明。

（圖2見插頁）

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（2014-11-03收稿 2015-01-12修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Using bioinformatics to analyze the effect of age on fracture healing

WANG Shunyi，LI Hui，HU Changqing，REN Dongliang，MA Weisong，LI Weifeng，YU Tao
The First Department of Orthopaedies，Baoding First Central Hospital，Baoding，Hebei 071000，China

Objective To explore the effect of age on the fracture healing through bioinformatical analysis of gene expression data in GEO，and to screen critical molecular targets and pathways involved in this process.Methods Through R programming language，we identified different expressed genes between 26/52 week old rats and 6 week old rats in every time points of the experiment（No fracture；3 days，1 week，2 weeks，4 weeks and 6 weeks after fracture）.By comparison of these different expressed genes，those genes that may contribute to fracture healing were identified.Function annotation was conducted based on DAVID database and PPI network that was constructed via STRING database.Results Compared with 6 week old rat，52 week old rat show more different genes at 2，4 and 6 weeks after fracture as well as more than intact rats.At the time point of 6 weeks after fracture，26 week old rat present 4 different genes while 52 week old rat present 99 different genes compared with 6 week old rat.We totally found 99 genes that might play important roles in the process of fracture healing.These genes involved in biological process related to bone healing，immune，inflammatory and etc.Also，two screened gene enriched KEGG pathways were identified:ECM-receptor interaction and Arachidonic acid metabolism.Through the analysis of PPI network，Pcna，F(xiàn)n1，Casp3 and etc，who present high density connectivity in PPI network，were screened out.Conclusion Pcna，Casp3 and Fn1 and etc might play important roles in fracture healing through affecting ECM-receptor interaction and Arachidonic acid metabolism.

computational biology；fracture；age factors；R programming language；pathway；PPI network

Q318.04

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.010

保定市第一中心醫(yī)院骨一科（郵編071000）

王順義（1970），男，副教授，碩士，主要從事創(chuàng)傷骨科、骨關節(jié)科研究