張志強(qiáng)，劉義，李克秋，李光

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離鑒定及免疫調(diào)節(jié)性能初探

張志強(qiáng)，劉義，李克秋，李光△

目的 分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），鑒定其向脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化潛能，并探討其免疫調(diào)節(jié)性能。方法 無菌條件下摘取Sprague-Dawley（SD）大鼠股骨和脛骨，全骨髓貼壁法培養(yǎng)BMSCs，胰酶消化傳代培養(yǎng)。待培養(yǎng)至第3代時(shí)進(jìn)行流式鑒定，檢測(cè)分離的BMSCs分化為脂肪細(xì)胞的潛能。與Wistar大鼠脾臟來源T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，分為直接接觸組和Transwell共培養(yǎng)組，探討其對(duì)T細(xì)胞亞群的影響，并研究其相關(guān)機(jī)制。結(jié)果BMSCs呈梭形生長(zhǎng)，生長(zhǎng)至第3代的細(xì)胞經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)幾乎不表達(dá)CD34和CD45，高表達(dá)CD29、CD44和CD90，且經(jīng)誘導(dǎo)后細(xì)胞可分化為脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。與脾臟來源T細(xì)胞共培養(yǎng)可有效降低CD8+的效應(yīng)T細(xì)胞（Teffs）的比例，并且增加CD4+CD25+雙陽性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）數(shù)量，具有一定的免疫調(diào)節(jié)性能。與T細(xì)胞共培養(yǎng)后BMSCs 的IL-10和TGF-β1基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，其中與T細(xì)胞直接接觸組效果更為明顯。結(jié)論 BMSCs可能通過直接接觸以及分泌細(xì)胞因子來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。

骨髓；間質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞分化；神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)；大鼠，Sprague-Dawley；大鼠，Wistar

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）為一群來自骨髓的多潛能干細(xì)胞，具有良好的再生和分化能力［1］。BMSCs起源于中胚層間質(zhì)，具有多向分化的能力［2］。利用其貼壁生長(zhǎng)特性可方便地進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，體外培養(yǎng)的BMSCs呈梭形，可聚集成均勻的集落［3］。有研究指出，BMSCs還具有良好的免疫調(diào)節(jié)性能，可通過細(xì)胞因子分泌和（或）細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸等對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞［4］、樹突狀細(xì)胞［5］、自然殺傷細(xì)胞［6］等產(chǎn)生影響，在免疫學(xué)研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠的BMSCs，通過流式檢測(cè)和誘導(dǎo)分化方法鑒定，并且與異基因的Wistar大鼠脾臟來源的T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，研究BMSCs對(duì)T細(xì)胞重要亞群的影響，并明確其作用機(jī)制，初步探討B(tài)MSCs的免疫調(diào)節(jié)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)成年雄性SD和Wistar大鼠，8～9周齡，體質(zhì)量200～220 g，各3只，購(gòu)于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 材料和試劑 胎牛血清（FBS）、胰酶購(gòu)自以色列Bioind公司；αMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司；4%多聚甲醛、紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、TRIzol、cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；油紅O和甲苯胺藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；流式標(biāo)記熒光抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；PCR檢測(cè)引物合成于北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 骨髓細(xì)胞的分離 無菌條件下分離SD大鼠的脛骨和股骨，剔除干凈肌肉，用注射器吸取含20%FBS的αMEM培養(yǎng)基沖出骨髓腔中的細(xì)胞，收集細(xì)胞并于室溫1 200 r/min離心5 min，棄掉上清，用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，再次離心5 min后以1×106個(gè)/mL密度接種于培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次。

1.2.2 BMSCs的培養(yǎng) 用胰酶消化法進(jìn)行BMSCs的常規(guī)傳代培養(yǎng)。分離的骨髓細(xì)胞在培養(yǎng)至6～7 d時(shí)達(dá)到約80%融合，吸棄培養(yǎng)基并用無菌PBS清洗1次，加入1 mL 0.025%胰酶，37℃消化5 min后以1∶2比例進(jìn)行傳代，此為第1代BMSCs，隨后約3 d傳代1次，待培養(yǎng)至第3代時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面分子 培養(yǎng)至第3代的BMSCs由胰酶消化成單細(xì)胞，按每管5×105個(gè)細(xì)胞分成6組樣品，PBS清洗1次，以異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的抗大鼠CD34、CD44、CD45、CD90和棗紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗大鼠CD29抗體，分別標(biāo)記5組細(xì)胞，4℃避光孵育30 min后用PBS清洗2次，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，未標(biāo)記的BMSCs作為流式檢測(cè)設(shè)門對(duì)照。

1.2.4 BMSCs體外誘導(dǎo)分化 將培養(yǎng)至第3代的BMSCs以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于12孔板的3個(gè)孔中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)棄去培養(yǎng)基，其中一孔加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，另一孔加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，剩余一孔作為正常培養(yǎng)對(duì)照。每3 d換液1次，約14 d時(shí)成脂誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂滴，成軟骨誘導(dǎo)的細(xì)胞融合成小球形狀。棄掉培養(yǎng)基，以4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS清洗后分別加入油紅O和甲苯胺藍(lán)染液，室溫染色20 min，PBS清洗后于光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.5 Wistar大鼠脾臟T細(xì)胞分離 無菌條件下摘取Wistar大鼠脾臟，用眼科剪剪成1 mm3的小塊，置于40 μm孔徑的篩網(wǎng)上，玻璃注射器內(nèi)芯輕輕碾磨組織，并用無菌PBS沖洗收集細(xì)胞懸液，室溫1 500 r/min離心5 min后棄去上清，用1 mL PBS重懸細(xì)胞，隨后加入3 mL紅細(xì)胞裂解液混勻，4℃孵育15 min后加入30 mL PBS室溫離心5 min，棄去上清，再用PBS清洗后將細(xì)胞以（5～10）×105個(gè)/mL密度接種于培養(yǎng)皿，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

1.2.6 BMSCs與T細(xì)胞共培養(yǎng) 將培養(yǎng)至第3代的BMSCs與新鮮提取的脾臟T細(xì)胞以1∶2比例進(jìn)行共培養(yǎng)，分兩種模式：一種為直接接觸型，即BMSCs與T細(xì)胞共同接種于培養(yǎng)板孔中；另一種以Transwell小室（8 μm孔徑）隔開BMSCs（小室中）和T細(xì)胞（培養(yǎng)板中），在RPMI 1640培養(yǎng)基中共培養(yǎng)48 h，BMSCs和T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照組，分別收集BMSCs和T細(xì)胞用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)與BMSCs共培養(yǎng)后T細(xì)胞分型的變化 將經(jīng)過兩種共培養(yǎng)方式處理的T細(xì)胞各分為2組，一組加入PE標(biāo)記的抗大鼠CD8抗體，另外一組加入FITC標(biāo)記的抗大鼠CD4抗體和PE標(biāo)記的抗大鼠CD25抗體，4℃避光孵育30 min后用PBS清洗2次，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，未標(biāo)記的新鮮T細(xì)胞作為流式檢測(cè)設(shè)門對(duì)照。

1.2.8 與 T細(xì)胞共培養(yǎng)前后BMSCs基因表達(dá)檢測(cè) 用TRIzol提取單獨(dú)培養(yǎng)及與T細(xì)胞混合培養(yǎng)的BMSCs的總RNA，經(jīng)cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用Real-time PCR方法檢測(cè)細(xì)胞的白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的表達(dá)水平，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）水平為基因表達(dá)內(nèi)參，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。引物序列見表1。

Tab.1 The primers used in Real-time PCR examination in ex vivo study表1 體外實(shí)驗(yàn)中Real-time PCR檢測(cè)所用的引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)志物 培養(yǎng)至第3代的BMSCs表面CD29、CD44和CD90表達(dá)均在80%以上，為高水平表達(dá)分子；CD34和CD45表達(dá)均低于2%，為低表達(dá)水平分子，見圖1。

2.2 BMSCs體外誘導(dǎo)鑒定 （1）體外誘導(dǎo)BMSCs向脂肪細(xì)胞分化的過程中，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生比較明顯變化，由最初呈梭形生長(zhǎng)（圖2A）逐漸變圓。加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液6 d時(shí)即可在光鏡下看到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)的脂滴逐漸增多，有的發(fā)生融合，形成較大的脂滴。待誘導(dǎo)到14 d時(shí)，BMSCs向脂肪細(xì)胞分化達(dá)到高峰，經(jīng)油紅O染色后可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)很多圓形、大小不一的脂滴，證實(shí)向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化成功，見圖2B。（2）誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化過程中，BMSCs由原來的長(zhǎng)梭形變?yōu)槿切位虿灰?guī)則形，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞間緊密接觸并逐漸融合成球形，14 d時(shí)甲苯胺藍(lán)染色顯示細(xì)胞內(nèi)蛋白聚糖陽性，證實(shí)向軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化成功，見圖2C。

2.3 BMSCs對(duì)脾臟T細(xì)胞分型的影響 BMSCs與異基因脾臟T細(xì)胞共培養(yǎng)后，BMSCs&T Transwell組脾臟Teffs細(xì)胞比例與BMSCs組相比降低14.27%，BMSCs&T直接接觸組與 BMSCs組相比降低27.72%，見圖3A；此外，BMSCs可顯著增加Tregs細(xì)胞的數(shù)量，BMSCs&T Transwell組與BMSCs組相比增加180.92%，且這種效應(yīng)在BMSCs&T直接接觸組中更加明顯，較BMSCs組增加231.30%，見圖3B。

Fig.1 The surface markers of rat BMSCs detected by flow cytometry圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠BMSCs表面標(biāo)記

Fig.2 The adipocyte and cartilage differentiation capacity of BMSCs圖2 BMSCs向脂肪和軟骨細(xì)胞分化的鑒定

Fig.3 The surface markers of spleen T cells and it co-culture with BMSCs for 48 hours detected by flow cytometry圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)與BMSCs共培養(yǎng)48 h后的脾臟T細(xì)胞表面標(biāo)記

2.4 BMSCs與脾臟T細(xì)胞共培養(yǎng)前后細(xì)胞因子表達(dá)變化 單獨(dú)培養(yǎng)的BMSCs表達(dá)一定水平的IL-10 和TGF-β1基因，與異基因脾臟T細(xì)胞共培養(yǎng)后可有效增強(qiáng)這2種細(xì)胞因子的水平，并且在BMSCs與T細(xì)胞直接接觸組中效果更強(qiáng)，見表2。

Tab.2 The relative transcription levels of IL-10 and TGF-β1 in rat BMSCs examined by Real-time PCR表2 Real-time PCR檢測(cè)大鼠BMSCs的IL-10和TGF-β1的相對(duì)表達(dá)量 （n=3，±s）

Tab.2 The relative transcription levels of IL-10 and TGF-β1 in rat BMSCs examined by Real-time PCR表2 Real-time PCR檢測(cè)大鼠BMSCs的IL-10和TGF-β1的相對(duì)表達(dá)量 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與BMSCs組比較，P＜0.05

組別BMSCs組BMSCs&T Transwell組BMSCs&T直接接觸組F TGF-β1 0.701±0.787 0.948±0.659 1.184±0.130a6.389＊IL-10 0.791±0.716 1.340±0.896a1.617±1.753a12.057＊＊

3 討論

3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的多潛能性 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類多潛能干細(xì)胞，在體內(nèi)各組織如骨髓、脂肪、骨骼肌等均有分布，尤其是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）易于分離培養(yǎng)，增殖能力強(qiáng)，在體內(nèi)外均能向多胚層來源的組織細(xì)胞分化［7］，能分泌多種細(xì)胞因子，是一種非常有應(yīng)用前景的種子細(xì)胞［8］。本實(shí)驗(yàn)成功分離得到SD大鼠的BMSCs，在體外培養(yǎng)中呈梭形生長(zhǎng)，增殖快速，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)至第3代的BMSCs高表達(dá)CD29、CD44和CD90分子，而幾乎不表達(dá)造血系的CD34和CD45分子，證實(shí)所獲得的BMSCs為典型的間充質(zhì)干細(xì)胞。經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理，BMSCs在體外可高效地向脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化，證實(shí)其具有良好的分化潛能。

3.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)性能 除增殖和分化潛能外，研究發(fā)現(xiàn)BMSCs表面只表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類分子，不表達(dá)或極少表達(dá)MHCⅡ類分子以及T細(xì)胞活化所需的共刺激分子B7-1、B7-2、CD40和CD40L等［9］，因而具有低免疫原性，可大大減少同種異體的移植排斥反應(yīng)，在干細(xì)胞移植和治療領(lǐng)域是非常理想的干細(xì)胞來源［10］。此外，BMSCs還具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性，據(jù)報(bào)道其可作用于免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞，包括樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）［11］、B細(xì)胞［12］、T細(xì)胞［13］、自然殺傷（NK）細(xì)胞等，并可通過分泌可溶性細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）等誘導(dǎo)免疫偏離，因而在免疫系統(tǒng)疾病的治療以及器官移植等領(lǐng)域備受關(guān)注。本研究通過將BMSCs與異基因的脾臟T細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察BMSCs 對(duì)T細(xì)胞中重要的亞群，包括CD8+的Teffs細(xì)胞及CD4+CD25+雙陽性的Tregs細(xì)胞的影響，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMSCs與脾臟T細(xì)胞共培養(yǎng)后可明顯降低Teffs細(xì)胞的數(shù)量并且增加Tregs細(xì)胞的比例，這種效應(yīng)在BMSCs與T細(xì)胞直接接觸組中更為顯著，提示細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸是BMSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的一個(gè)重要前提。同時(shí)，Transwell共培養(yǎng)的方式隔開BMSCs與T細(xì)胞時(shí)，這種效果仍比較明顯，提示BMSCs可能通過分泌一些可溶性細(xì)胞因子參與對(duì)T細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)。隨后，筆者用Real-time PCR方法檢測(cè)了BMSCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)后的IL-10和TGF-β1細(xì)胞因子的基因表達(dá)，證實(shí)與T細(xì)胞共培養(yǎng)過程中BMSCs的兩種細(xì)胞因子水平均得到明顯提高，尤其直接接觸組中最為顯著。上述結(jié)果提示BMSCs可能是通過分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞-細(xì)胞的直接接觸作用來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性。

3.3 前景展望 本實(shí)驗(yàn)獲得了可在體外大量培養(yǎng)擴(kuò)增的大鼠BMSCs，且具有良好的分化潛能，此外，初步探討了BMSCs的免疫調(diào)節(jié)性能，發(fā)現(xiàn)BMSCs可對(duì)異基因的脾臟T細(xì)胞一些亞群包括Teffs和Tregs產(chǎn)生影響，可有效降低Teffs細(xì)胞比例并且增加Tregs細(xì)胞數(shù)量，明確了這種影響產(chǎn)生的機(jī)制，不僅豐富了BMSCs免疫調(diào)節(jié)功能的研究，而且為BMSCs在免疫學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的支持。

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（2014-10-08收稿 2014-11-28修回）

（本文編輯 李鵬）

Isolation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells and explore its role in immunomodulation

ZHANG Zhiqiang，LIU Yi，LI Keqiu，LI Guang△
Department of Biology，Basic Medical College，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China
△Corresponding Author E-mail：lig@tijmu.edu.cn

Objective To explore the immunomodulation property of bone marrow-derived mesenchymal stem cells （BMSCs）from Sprague-Dawley（SD）rats after they are isolated，cultured and identified by surface marker and differentiation potential examination.Methods BMSCs were isolated from femur and tibia of SD rats and passaged by trypsinization.The surface markers of the 3rdpassage BMSCs were detected by flow cytometry and the capacity of their adipocyte and cartilage differentiation were examined.In order to explore the immunomodulation property of BMSCs，allogeneic spleen T cells of Wistar rats were co-cultured with BMSCs through either cell-to-cell contact or transwell，then its effect on the T cell subsets and related mechanism was also examined.Results BMSCs were mainly spindle-shaped in culture.Surface marker detection showed that BMSCs expressed high levels of CD29，CD44 and CD90 but no CD34 nor CD45 at the third generation.Under specific condition，BMSCs could differentiate into adipocytes and chondrocytes.The CD8+effector T cells（Teffs）decreases effectively and the CD4+CD25+regulatory T cells（Tregs）increased remarkably when BMSCs were co-cultured with allogeneic spleen T cells for 48 hours.The expressions of IL-10 and TGF-β1 of BMSCs significantly increased after co-culture with T cells，and this effect was more obvious in cell-to-cell contact group.Conclusion The immunomodulation property of BMSCs were presumably function through cell-to-cell contacts and cytokine secretion.

bone marrow；mesenchymal stem cells；cell differentiation；neuroimmunomodulation；rats，Sprague-Dawley；rats，Wistar

R349.5

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.009

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）資助項(xiàng)目（2012AA021003）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21177091）；天津市科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目（12ZCZDSY03400）

天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室（郵編300070）

張志強(qiáng)（1988），男，碩士在讀，主要從事免疫耐受方面研究

△E-mail：lig@tijmu.edu.cn