蔡英，黃慧玲，范維佳，武俏麗，李曉茜，蘇彥華，溫曉昶

重型顱腦創(chuàng)傷大鼠后期腦水腫研究及?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體的作用

蔡英，黃慧玲△，范維佳，武俏麗，李曉茜，蘇彥華，溫曉昶

目的 研究牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（TauT）在?；撬嵴{(diào)節(jié)重型顱腦創(chuàng)傷大鼠后期腦水腫中的作用。方法 將40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組:假手術(shù)組（Sham組）、腦外傷組（TBI組）、?；撬犷A(yù)防組（Pre-Tau組）和牛磺酸治療組（Tau組）。液壓沖擊法制作重型顱腦創(chuàng)傷大鼠模型。Pre-Tau組和Tau組分別在造模前或后給予120 g/L的?；撬崛芤?，其他兩組給予等量的等滲生理鹽水。7 d后用干濕重法檢測(cè)腦組織中腦水含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot方法檢測(cè)TauT和水通道蛋白（AQP4）的mRNA表達(dá)及蛋白含量。結(jié)果 與Sham組相比，TBI組腦水含量、AQP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，TauT的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低。與TBI組比較，Pre-Tau組和Tau組腦水含量、AQP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低、TauT的mRNA表達(dá)明顯升高；Tau組TauT的蛋白表達(dá)明顯升高；Pre-Tau組TauT的蛋白表達(dá)有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AQP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平與腦水含量呈正相關(guān)（r分別為0.621和0.457），AQP4的mRNA與蛋白表達(dá)亦呈正相關(guān)（r=0.459）。結(jié)論 ?；撬嵬ㄟ^(guò)提高重型顱腦創(chuàng)傷大鼠后期TauT的表達(dá)水平，降低腦水含量和AQP4的表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。

?；撬?；腦損傷；膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)類；腦水腫；水通道蛋白質(zhì)4；大鼠，Sprague-Dawley；牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)體

?；撬幔╰aurine，Tau）是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、維持功能所不可缺少的氨基酸，具有抑制性遞質(zhì)的作用［1-2］。細(xì)胞內(nèi)高濃度的?；撬崴绞瞧浒l(fā)揮作用的基礎(chǔ)，?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體（taurine transporter，TauT）逆濃度梯度將血漿中?；撬峥缒ぶ鲃?dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)聚集是形成細(xì)胞內(nèi)高濃度?；撬岬闹饕绞?。重型顱腦創(chuàng)傷（severe traumatic brain injury，sTBI）是神經(jīng)外科常見(jiàn)的疾病，具有很高的致死率和致殘率［3］。腦水腫引起的顱內(nèi)壓增高是顱腦創(chuàng)傷后最重要的病理反應(yīng)［4］。水通道蛋白4（AQP4）是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)最主要的水通道蛋白，與腦脊液的產(chǎn)生和重吸收有關(guān)，在腦水腫的形成過(guò)程中起關(guān)鍵性作用［5-6］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Tau具有顯著改善顱腦創(chuàng)傷大鼠腦血流、血液凝固狀態(tài)和代謝紊亂等腦保護(hù)作用［7］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Tau治療和預(yù)防TBI，觀察TBI后期的腦水腫等情況，旨在進(jìn)一步闡明Tau對(duì)TBI大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用品

1.1.1 試劑 ?；撬幔绹?guó)Sigma公司），RNA提取試劑、熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和RNA酶抑制劑（美國(guó)Life Technologies公司），總蛋白提取試劑盒和BCA法蛋白定量試劑盒（美國(guó)Thermo公司），羊抗TauT多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），兔抗AQP4抗體（美國(guó)Abcam公司），β-actin抗體（美國(guó)Biotech公司），HRP標(biāo)記二抗（北京中杉金橋公司），ECL熒光化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Millipore公司）。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 DY-1型動(dòng)物腦立體定位儀（天津市醫(yī)療器械研究所），液壓腦創(chuàng)傷打擊儀（美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)），Strong 90型電動(dòng)磨鉆（韓國(guó)Sae Shin Precision公司），UNICAM UV 300型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司），Avanti-30型臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司），Miniprotean Tetra Cell型電泳系統(tǒng)、Mini Trans-Blot Cell型轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)和CFX384型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)BIO-RAD公司），Gene genius型凝膠成像及分析系統(tǒng)（美國(guó)Syngene公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠40只，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0004］，體質(zhì)量（290±20）g。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組）、腦外傷組（TBI組）、?；撬犷A(yù)防組（Pre-TBI組）和?；撬嶂委熃M（Tau組），每組10只。實(shí)驗(yàn)中死亡或不符合標(biāo)準(zhǔn)的大鼠均重新造模補(bǔ)齊。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 顱腦創(chuàng)傷模型制作及分組 根據(jù)文獻(xiàn)［7］的方法制作大鼠TBI模型：經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉動(dòng)物，將頭部固定于動(dòng)物腦立體定位儀。頭部消毒后正中切開(kāi)2 cm，剝離骨膜，在顱骨前囟左后4.5 mm、矢狀縫左旁2.5 mm鉆一直徑為5 mm的骨窗。將無(wú)菌打擊管兩端分別固定于骨窗和液壓腦創(chuàng)傷打擊儀的沖擊嘴，調(diào)節(jié)壓力為1.8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，進(jìn)行液壓打擊，制作重型顱腦創(chuàng)傷大鼠模型。

1.2.2 牛磺酸溶液的配制及給藥 將2 400 mg?；撬崛苡?5 mL等滲鹽水中，充分溶解后用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，定容為20 mL，制成120 g/L的?；撬崛芤?，在無(wú)菌室內(nèi)經(jīng)0.25μm濾器過(guò)濾后保存?zhèn)溆?。Sham組，只開(kāi)骨窗，不打擊，尾靜脈即刻注射0.5 mL等滲鹽水，并連續(xù)注射7 d。TBI組，用液壓打擊儀制作sTBI模型，造模成功后，尾靜脈即刻注射0.5 mL等滲鹽水，連續(xù)7 d。Pre-Tau組和Tau組分別在造模前連續(xù)4 d或造模成功后連續(xù)7 d給予尾靜脈注射?；撬崛芤?。

1.2.3 腦組織含水量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于7 d后斷頭處死，迅速在冰上取傷側(cè)（左側(cè)）大腦組織，將皮質(zhì)表面軟腦膜剔除干凈，濾紙吸干表面水分及血漬，取損傷區(qū)前緣約30 mg腦組織稱濕質(zhì)量后放入電熱恒溫干燥箱內(nèi)105℃烤24 h至質(zhì)量恒定，稱干質(zhì)量（兩次干質(zhì)量差應(yīng)＜0.000 2 g）。根據(jù)Eliot公式計(jì)算腦組織含水量：腦組織含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。剩余傷側(cè)腦組織液氮研磨成粉末，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)腦組織中TauT和AQP4基因表達(dá)量 按照TRIzol Reagent試劑說(shuō)明書提取腦組織總RNA。用紫外分光光度計(jì)和甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度、純度和完整性。取2 μg總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肎ene Runner軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，經(jīng)Blast檢索無(wú)同源性，由北京Life Technologies生物技術(shù)公司合成。TauT基因引物序列：上游5′-418GAGGTCATCATAGGCCAGTAC438-3′，下游5′-537GTACACATTCAGGAGGGACAC507-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為120 bp；AQP4引物序列為：上游5′-253GTTCAGTGCTTCGGCCACAT272-3′，下游5′-362GCAGTGATGTAGAAGACGGACTT340-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為 110 bp；β-actin基因引物序列：上游 5′-410GAACCCTAAGGCCAACCGTG429-3′，下游5′-514AGGCATACAGGGACAACACAG493-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為105 bp。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)TauT和AQP4的mRNA表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。20μL PCR反應(yīng)體系為：10μL的2×SYBR GREEN MIX，上下游引物（10 μmol/L）各1μL，1μL的cDNA，補(bǔ)充ddH2O至20μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，退火15 s，72℃延伸15 s，循環(huán)40次；最后72℃延伸5 min。TauT、AQP4和β-actin的退火溫度分別為62℃、60℃和55℃。樣本目的基因的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式為：相對(duì)表達(dá)量=2-△Ct（△Ct=Ct1-Ct2；Ct1：樣品待測(cè)基因的臨界循環(huán)數(shù)；Ct2：樣品管家基因的臨界循環(huán)數(shù)）。

1.2.5 Western Blot法檢測(cè)腦組織中TauT和AQP4蛋白表達(dá)量 按照總蛋白提取說(shuō)明書抽提腦組織總蛋白：取500 mg液氮研磨的腦組織粉末放入勻漿器中球狀部位，加入0.5 mL的總蛋白提取試劑，于勻漿器中進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。裂解30 min后，用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，然后在4℃下12 000 r/min離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中并置于-20℃保存，此為提取的腦組織總蛋白。BCA法定量后用蛋白溶解液調(diào)整蛋白濃度為5 g/L，取40μg總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），切取包含TauT（64 ku）、AQP4（34 ku）或β-actin（42 ku）的凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，110 V，90 min，用5%脫脂奶粉封閉2 h，按照分子質(zhì)量大小剪開(kāi)硝酸纖維素（NC）膜后，分別加入TauT（1∶200）、AQP4（1∶500）或β-actin（1∶1 000）抗體，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次2 mL，洗滌5 min。加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶500）常溫孵育2 h。棄掉二抗，再次TBST洗膜3次。加入1 mL ECL發(fā)光液與膜充分接觸，于成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。樣本中目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量為目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin蛋白條帶凈吸光度值的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，用Kolmogorov-Smirnov法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布情況，如符合則采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），多重比較采用LSD-t法，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦水含量檢測(cè) 與Sham組相比，TBI組腦水含量顯著升高，Pre-Tau組和Tau組腦水含量與TBI組比較明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Water content，mRNA transcription and protein expression levels of TauT and AQP4 in injured cerebral hemisphere in all four groups表1 ?；撬嶂委熀髠麄?cè)大腦組織腦水含量、TauT和AQP4的mRNA及蛋白表達(dá)情況（n=10，±s）

Tab.1 Water content，mRNA transcription and protein expression levels of TauT and AQP4 in injured cerebral hemisphere in all four groups表1 ?；撬嶂委熀髠麄?cè)大腦組織腦水含量、TauT和AQP4的mRNA及蛋白表達(dá)情況（n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與TBI組比較，P＜0.05

?

2.2 AQP4和TauT的mRNA及蛋白表達(dá) 與Sham組相比，TBI組腦組織AQP4 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著升高，TauT mRNA及蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。與TBI組比較，Pre-Tau組和Tau組AQP4 mRNA及蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；Tau 組TauT mRNA及蛋白表達(dá)量比TBI組明顯升高（P＜0.05），Pre-Tau組的TauT mRNA表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表1。

2.3 AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)與腦水含量的相關(guān)性分析 AQP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平與腦水含量呈正相關(guān)（r分別為0.621和0.457，P＜0.05），AQP4 的mRNA與蛋白表達(dá)亦呈正相關(guān)（r=0.459，P＜0.05）。

Fig.1 TauT and AQP4 protein expression levels in the injured cerebral hemisphere in all four groups圖1 ?；撬嶂委熀髠麄?cè)腦組織TauT和AQP4蛋白表達(dá)

3 討論

?；撬嵋院聊柫糠植加谀X組織中，通過(guò)TauT介導(dǎo)，選擇性攝入和釋放?；撬幔l(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)功能。牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)可以被?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑2-胍基乙磺酸（GES）所抑制，使細(xì)胞內(nèi)的?；撬釢舛却蟠蠼档停?］，TauT-/-小鼠的多個(gè)組織?；撬岷看蟠蠼档停?-10］。因此，?；撬嶙饔玫陌l(fā)揮依賴于TauT數(shù)量和結(jié)構(gòu)的正常。本實(shí)驗(yàn)在sTBI后尾靜脈注射?；撬峥梢杂行дT導(dǎo)腦組織TauT的mRNA和蛋白表達(dá)，說(shuō)明在病理情況下，外源性?；撬崮軌蛟鰪?qiáng)腦細(xì)胞膜上TauT的表達(dá)以維持細(xì)胞內(nèi)Tau的生理濃度，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［11］。在本實(shí)驗(yàn)中，預(yù)防性地應(yīng)用?；撬嵋部捎行岣吣X組織TauT的mRNA表達(dá)量，其機(jī)制可能是細(xì)胞外高濃度的?；撬崾辜?xì)胞處于一種“活化”的狀態(tài)，能夠隨時(shí)對(duì)外界刺激如腦外傷做出應(yīng)答以保護(hù)機(jī)體，這可能是機(jī)體的一種儲(chǔ)備功能。Pre-Tau組TauT蛋白的表達(dá)與TBI組比較有升高的趨勢(shì)，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是大鼠在未受到TBI損傷時(shí)，給予尾靜脈注射?；撬幔m然增加了血液中的牛磺酸濃度，使細(xì)胞處于一種“活化”的狀態(tài)，但是并不能改變機(jī)體內(nèi)TauT蛋白的正常水平。此時(shí)的大鼠在受到腦外傷時(shí)，停止了外源性?；撬崛芤旱墓┙o，只能依靠“活化”的細(xì)胞誘導(dǎo)TauT mRNA的高表達(dá)，在TBI后翻譯出大量的TauT蛋白，使血漿中的?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮?；撬岬纳窠?jīng)元保護(hù)作用，降低腦水腫。但細(xì)胞內(nèi)高水平的牛磺酸可反饋性地抑制TauT的表達(dá)［12］，使預(yù)防組的TauT蛋白表達(dá)量下降。

AQP4作為腦組織內(nèi)含量最為豐富的水通道蛋白，參與介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和離子平衡，在腦內(nèi)水平衡的調(diào)節(jié)上起主要作用［13］，與腦水腫的發(fā)生密切相關(guān)。Qing等［14］檢測(cè)了大鼠腦出血后腦水含量和腦組織AQP4 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示腦水含量和AQP4 mRNA在腦出血1 d即有升高，3 d達(dá)到峰值，7 d和14 d仍在高水平，且AQP4 mRNA的表達(dá)和腦水含量呈正相關(guān)關(guān)系。說(shuō)明AQP4在腦水腫的形成過(guò)程中起重要作用。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于TBI后腦水腫的文獻(xiàn)多集中在TBI后的早期即12 h、24 h、48 h或72 h［15-16］，TBI后期（7 d）的腦水腫情況少有報(bào)道。Oliva等［17］報(bào)道中度TBI 后7 d大鼠傷側(cè)皮質(zhì)AQP4的蛋白表達(dá)水平較Sham組顯著下降，海馬AQP4的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著性變化，而本研究結(jié)果顯示重度TBI后7 d大鼠傷側(cè)大腦半球的AQP4的蛋白表達(dá)水平較Sham組顯著上升，與上述文獻(xiàn)結(jié)果不同。其原因一是由于Oliva等的動(dòng)物模型為中度TBI模型，本研究動(dòng)物模型為重度TBI模型；二是檢測(cè)部位不同，Oliva等分別檢測(cè)傷側(cè)的皮質(zhì)和海馬，本研究為傷側(cè)大腦半球。這就說(shuō)明AQP4在不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、不同的組織部位具有不同的表達(dá)情況。

本研究結(jié)果顯示，sTBI組的腦水含量與AQP4 的mRNA和蛋白表達(dá)都升高，說(shuō)明AQP4參與了重型顱腦創(chuàng)傷性腦水腫的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。?；撬犷A(yù)防與治療可以有效降低TBI后7 d腦水含量與AQP4 的mRNA和蛋白表達(dá)量。這與筆者前期對(duì)腦外傷后早期24 h的研究結(jié)果一致［7］，說(shuō)明?；撬峋哂蟹乐筎BI后腦水腫的作用。機(jī)制可能是TBI后繼發(fā)創(chuàng)傷性腦水腫，引起細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓不平衡，細(xì)胞外的高滲狀態(tài)通過(guò)誘導(dǎo)牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)［18］，使?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)牛磺酸濃度升高不僅可以通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞膜、清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化等功能來(lái)減輕腦水腫的程度，從而間接調(diào)節(jié)AQP4的mRNA和蛋白表達(dá)量；還可以通過(guò)某些環(huán)節(jié)抑制AQP4的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，從而直接降低AQP4的mRNA和蛋白表達(dá)。

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（2015-01-08收稿 2015-03-05修回）

（本文編輯 魏杰）

Protection role of taurine transporter in rats brain edema followed severe traumatic head injury

CAI Ying，HUANG Huiling△，F(xiàn)AN Weijia，WU Qiaoli，LI Xiaoqian，SU Yanhua，WEN Xiaochang
Tianjin Huanhu Hospital，Neurosurgery Institute of Tianjin，Tianjin Cerebrovascular and Neurodegeneration Key Laboratory，Tianjin 300060，China
△Corresponding Author E-mail：huanghuiling@126.com

Objective To investigate the effect of taurine transporter in the process of protection of brain edema in rats with severe traumatic head injury.Methods A total of 24 Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups.Except the control rats（Group Sham），all other three groups were subjected to lateral fluid percussion head injury.The TBI （Traumatic brain injury）models（Group TBI）and surgical control rats（Group Sham）were injected with saline through caudal vein after surgery，while the Taurine prevention and Taurine treatment models（Group Pre Tau and Group Tau）were injected with 120 g/L taurine solution before or after surgeries respectively.Water content in each brain，mRNA and protein expression of aquaporin 4 and taurine transporter in the injured rat brain hemispheres were all evaluated over the time course of the study（7 d）in each group.Results Compared with rats in Group Sham，water content in each brain increase，mRNA transcription and protein expression of AQP4 were both up regulated but the mRNA transcription and protein expression of TauT were both down-regulated in rats in TBI group.Compared with rats in TBI group，brain water content，mRNA transcription and protein expression of AQP4 all decrease while mRNA transcription and protein expression of TauT all increase in rats in Pre tau and Tau groups.There is no statistical difference of TauT expression between rats in pre-tau group and Tau group.Conclusion Taurine exert its neuron protection role through draining water content from brain and down regulating expression of AQP4 but rising expression of TauT after TBI.

Taurine；brain injuries；membrane transport proteins；brain edema；aquaporin 4；rats，Sprague-Dawley；taurine transporter

R651.15

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.008

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30973089）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（10JCYBJC23200）；天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目（2012KR09）

天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津市神經(jīng)外科研究所，天津市腦血管與神經(jīng)變性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編300060）

蔡英（1978），女，碩士，助理研究員，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)損傷與修復(fù)方面研究

△E-mail：huanghuiling@126.com