杜立龍，徐寶山，楊強(qiáng)，馬信龍，李秀蘭，張楊，郭悅，丁曉明，祁霽舟，趙家寧

絲素蛋白來源的一體化纖維環(huán)-髓核支架的制備與評(píng)估

杜立龍1，2，徐寶山2△，楊強(qiáng)2，馬信龍2，李秀蘭2，張楊2，郭悅2，丁曉明1，2，祁霽舟1，2，趙家寧1，2

目的 評(píng)估以絲素蛋白為材料構(gòu)建的一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架作為組織工程椎間盤支架的可行性。方法 以絲素蛋白溶液為原料，分別采用石蠟球致孔法和相分離法制備三維多孔一體化纖維環(huán)-髓核支架。采用體視顯微鏡、掃描電鏡觀察支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測(cè)定雙相支架纖維環(huán)相和髓核相的孔徑、孔隙率及一體化壓縮彈性模量；分離培養(yǎng)兔纖維環(huán)細(xì)胞和髓核細(xì)胞，接種至雙相支架的相應(yīng)部位，體外培養(yǎng)48 h，掃描電鏡、死活（Live/dead）細(xì)胞染色評(píng)價(jià)支架與細(xì)胞的生物相容性；CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果 體視顯微鏡和掃描電鏡可見雙相支架纖維環(huán)相和髓核相均呈相互連通的多孔結(jié)構(gòu)，孔隙高度連通，纖維環(huán)髓核交接區(qū)域結(jié)合緊密；纖維環(huán)相孔徑為（220.0±23.1）μm，髓核相孔徑為（90.0±17.8）μm；孔隙率分別為91%和93%；一體化支架壓縮彈性模量為（150.7±6.8）kPa。掃描電鏡可見均勻地黏附在支架表面，細(xì)胞周圍有細(xì)胞外基質(zhì)分泌；Live/dead染色顯示細(xì)胞在支架上活性良好，無死細(xì)胞；CCK-8增殖分析顯示纖維環(huán)細(xì)胞和髓核細(xì)胞均具有良好的增殖活性。結(jié)論 以天然絲素蛋白構(gòu)建一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架，具有良好的孔徑、孔隙率和細(xì)胞相容性，一體化支架兩部分結(jié)合緊密，并且具有優(yōu)越的力學(xué)性能，是構(gòu)建組織工程椎間盤的理想支架載體。

組織工程；絲素蛋白；椎間盤；支架；纖維環(huán)；髓核

椎間盤退變性疾病是臨床常見疾病，具有發(fā)病率高及致殘率高的特點(diǎn)［1］。當(dāng)前椎間盤退變性疾病的治療措施主要有單純髓核摘除、椎間盤切除及植骨融合固定等［2］。然而，這些措施只能暫時(shí)緩解癥狀，術(shù)后易復(fù)發(fā)、無法根治，甚至加速相鄰節(jié)段退變，遠(yuǎn)期效果不盡滿意，因此，需要探索理想的重建修復(fù)措施［3］。近年來組織工程技術(shù)成為研究的熱點(diǎn)，有望為椎間盤疾病的治療提供理想的修復(fù)措施［4］。選擇合適的支架材料和種子細(xì)胞是構(gòu)建組織工程椎間盤的關(guān)鍵［4］。絲素蛋白作為一種天然材料，具有優(yōu)越的力學(xué)特性和生物降解性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于骨和軟骨組織工程［5-6］。本研究以絲素蛋白為材料，構(gòu)建一體化纖維環(huán)-髓核支架，并分別復(fù)合纖維環(huán)細(xì)胞和髓核細(xì)胞，通過理化性能分析、力學(xué)分析、組織學(xué)觀察及細(xì)胞生物相容性研究，探討其作為組織工程椎間盤支架的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔4只，雌雄不限，質(zhì)量約2 kg，用于椎間盤組織取材，由天津醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑、儀器 桑蠶絲（江蘇蘇州）；LiBr、Na2CO3（天津市化學(xué)試劑三廠）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，美國）；死活細(xì)胞（Live/dead）染色試劑（Invitrogen，美國）；掃描電子顯微鏡（SEM，Hitachi，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Leica，TCS，德國）；酶標(biāo)儀（iMark，Bio RAD，日本）；體式顯微鏡（Leica，S8APO，德國）；冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康技術(shù)公司）。

Fig.1 Teflon mold of scaffold preparation圖1 支架制備Teflon模具

1.3 一體化支架的制備 （1）絲素蛋白溶液的制備：桑蠶絲用0.02 mol/L的Na2CO3溶液脫膠，晾干后，溶解在9.3 mol/L LiBr溶液中，去離子水中透析3 d，15%聚乙二醇中濃縮，得到20%的絲素蛋白溶液［7］。（2）纖維環(huán)相的制備：采用特制的Teflon模具，將石蠟球加入模具中，見圖1，然后將20%的絲素蛋白溶液加入石蠟球上方，并置于真空中以使絲素蛋白溶液均勻地滲透到石蠟球之間的孔隙中。（3）髓核相的制備：拔除模具中間的圓柱形不銹鋼棒，迅速將7%絲素蛋白與15%乙醇的混合溶液注射到中間。將其置于-20℃中12 h，凍干48 h，取出絲素蛋白一體化支架，將其置于索氏萃取器中脫去支架中的石蠟球，室溫下晾干，得到絲素蛋白一體化支架。

1.4 組織工程椎間盤的構(gòu)建 （1）分離培養(yǎng)兔纖維環(huán)細(xì)胞和髓核細(xì)胞［8］。將大白兔處死后，立即皮膚消毒。背部正中切口，依次切開皮膚、皮下組織，暴露脊柱，分離脊柱周圍附著的肌肉韌帶；取出脊柱，切開椎間盤，分離出纖維環(huán)和髓核組織，Hank′s液（含100 U/mL青霉素和鏈霉素）漂洗3遍，剪碎成1 mm3組織塊。用0.2%Ⅱ型膠原酶于37℃分別消化纖維環(huán)和髓核組織2～3 h和3～4 h，用200目濾網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心10 min，所得的細(xì)胞沉淀以含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液稀釋一定倍數(shù)后，接種到培養(yǎng)瓶中。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液。（2）一體化支架經(jīng)高溫高壓消毒后，浸泡DMEM（10%FBS）過夜。用濾紙吸干支架內(nèi)的液體，將消化獲得20 μL P2代髓核細(xì)胞（1×107個(gè)/mL）接種到一體化支架的髓核相，至其飽和；然后將消化獲得20 μL P2代纖維環(huán)細(xì)胞（1×107個(gè)/mL）均勻接種到一體化支架的外周纖維環(huán)相。將上述細(xì)胞-支架復(fù)合物置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育3～4 h，使細(xì)胞充分貼壁；移至24孔板中培養(yǎng)，每天換液。

1.5 一體化纖維環(huán)-髓核支架的性能評(píng)估

1.5.1 大體觀察 觀察支架的大體形態(tài)、結(jié)構(gòu)；將支架用刀片切成2 mm厚，于體式顯微鏡下觀察。

1.5.2 掃描電鏡觀察 將支架切成厚1 mm薄片，臨界點(diǎn)干燥，表面噴金處理后，于掃描電鏡下觀察。

1.5.3 支架孔徑、孔隙率測(cè)定 孔徑：取5個(gè)樣本的100倍掃描電鏡圖片，每個(gè)樣本隨機(jī)讀取5張不同視野圖片，每張圖片分別測(cè)量3個(gè)不同孔的直徑，計(jì)算纖維環(huán)相和髓核相的孔徑?？紫堵剩悍謩e取纖維環(huán)相和髓核相支架，采用液體置換法計(jì)算支架孔隙率（ε）［9］。將一定質(zhì)量的樣品置入盛有一定體積（V1）乙醇的刻度量筒中，循環(huán)抽真空至無氣泡逸出，記錄樣品和乙醇的總體積V2；取出浸滿乙醇的支架，剩余乙醇體積記為V3。ε=（V1-V3）/（V2-V3）×100%。測(cè)試5個(gè)平行樣品，每個(gè)樣品測(cè)3次，取均值。

1.5.4 細(xì)胞生物相容性檢測(cè) （1）掃描電鏡觀察：細(xì)胞-支架復(fù)合物培養(yǎng)48 h后，用2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，臨界點(diǎn)干燥，表面噴金，掃描電鏡觀察。（2）Live/dead染色觀察：細(xì)胞-支架復(fù)合物培養(yǎng)48 h后，吸除培養(yǎng)液，PBS洗2遍，加入Live/dead染液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育30 min，共聚焦顯微鏡下觀察。（3）細(xì)胞增殖分析（CCK-8檢測(cè)）：細(xì)胞-支架復(fù)合物分別培養(yǎng)至第1、3、5、7天后，移除培養(yǎng)液，PBS洗2遍，加入500μL CCK-8（10%）溶液，37℃孵育3 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)在450 nm時(shí)的光密度（OD）值。

1.5.5 支架力學(xué)性能測(cè)試 支架浸入PBS中復(fù)水4 h以上，置于力學(xué)加載儀器上，以1 mm/min恒定速度進(jìn)行壓縮測(cè)試，計(jì)算機(jī)記錄位移-載荷，繪制位移載荷曲線。取曲線起始較平緩階段，計(jì)算壓縮彈性模量。彈性模量=應(yīng)力/應(yīng)變。即：E=（F/S）/（dL/L），其中F代表截面的載荷，S代表截面面積，dL代表支架高度的變化，L代表支架原始高度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體及顯微鏡觀察 一體化支架外徑10 mm，呈圓柱狀多孔結(jié)構(gòu)；可見明顯的雙相結(jié)構(gòu)，并且兩相之間未見分離。體視顯微鏡下見一體化支架纖維環(huán)相和髓核相均呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑均勻，孔隙高度連通，交界區(qū)結(jié)合緊密，見圖2A～C。

2.2 掃描電鏡觀察 可見雙相支架纖維環(huán)相和髓核相均呈相互連通的多孔結(jié)構(gòu)，孔隙高度連通，纖維環(huán)髓核交接區(qū)域結(jié)合緊密，見圖2D～F。

2.3 支架孔徑、孔隙率測(cè)定 纖維環(huán)相孔徑為（220.0±23.1）μm，髓核相孔徑為（90.0±17.8）μm；纖維環(huán)相髓核相孔隙率分別為91%和93%。

2.4 細(xì)胞生物相容性檢測(cè) 掃描電鏡可見細(xì)胞呈球狀或短梭形均勻地黏附在支架表面及內(nèi)部，細(xì)胞周圍有細(xì)胞外基質(zhì)分泌，見圖3；Live/dead細(xì)胞染色顯示細(xì)胞在支架上活性良好（綠色），無死細(xì)胞（紅色），見圖4；CCK-8增殖分析顯示纖維環(huán)和髓核細(xì)胞在第1、3、5、7天時(shí)OD值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為58.470和22.940，均P＜0.01）；表明纖維環(huán)細(xì)胞和髓核細(xì)胞均具有良好的增殖活性，見圖5 A。

2.5 支架力學(xué)性能測(cè)試 濕潤(rùn)狀態(tài)下支架的典型載荷-位移曲線見圖5B。取曲線起始部分，根據(jù)公式測(cè)得復(fù)水狀態(tài)下，一體化支架壓縮彈性模量為（150.7±6.8）kPa。

Fig.5 Cell metabolic activity and load-displacement curve圖5 細(xì)胞增殖活性和載荷位移曲線

3 討論

3.1 組織工程椎間盤的特點(diǎn) 椎間盤退變是引起腰痛、脊柱活動(dòng)受限的主要原因。椎間盤退變主要表現(xiàn)在髓核組織細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞外基質(zhì)脫水、力學(xué)性能減弱，同時(shí)伴隨纖維環(huán)組織生化成分、微結(jié)構(gòu)的紊亂、受力失衡，導(dǎo)致纖維環(huán)破裂，髓核突出，從而引起病變［10］。組織工程學(xué)方法為椎間盤退變提供了新的再生策略。當(dāng)前組織工程椎間盤主要集中于研究單純的髓核再生和單純的纖維環(huán)再生［11］，而椎間盤退變是纖維環(huán)和髓核組織同時(shí)存在病變。因此，構(gòu)建一體化的組織工程椎間盤成為當(dāng)前的研究重點(diǎn)。

3.2 支架材料研究進(jìn)展和選擇 合適的支架材料是構(gòu)建組織工程椎間盤的基礎(chǔ)。理想的支架材料應(yīng)該具備良好的生物相容性、適當(dāng)?shù)纳锝到庑砸约皟?yōu)越的力學(xué)特性［12］。當(dāng)前構(gòu)建組織工程髓核的支架材料主要有藻酸鹽、膠原-蛋白凝膠、脫細(xì)胞基質(zhì)、Ⅱ型膠原/透明質(zhì)酸/6-硫酸軟骨素復(fù)合材料等［13］；構(gòu)建組織工程纖維環(huán)的支架材料主要包括聚己內(nèi)酯、透明質(zhì)酸、聚乳酸、膠原、聚氨酯等［14］。然而這些研究局限于構(gòu)建單純的纖維環(huán)或者髓核組織。絲素蛋白作為一種天然材料，其不僅具有合適的生物降解性，并且具有優(yōu)越的力學(xué)特性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于骨、軟骨組織工程。Mandal等［15］以絲素蛋白為材料制備三層仿生半月板支架，復(fù)合人成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，結(jié)果表明2種細(xì)胞均能在絲素支架上良好地生長(zhǎng)增殖，并分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，提示絲素蛋白支架具有適合細(xì)胞生長(zhǎng)的良好生物相容性。Meinel等［5］采用三維多孔絲素蛋白支架并復(fù)合間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)鼠顱蓋骨缺損，通過檢測(cè)基因表達(dá)、生化分析及X線分析等發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞-絲素蛋白組織工程替代物能夠很好地修復(fù)骨缺損，有利于骨重建和再生，并且具有良好的力學(xué)穩(wěn)定性。本研究中，筆者在前期研究的基礎(chǔ)上［16］，以天然絲素蛋白為材料，采用石蠟致孔法和相分離法2種不同方法，模擬天然椎間盤的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性，并分別復(fù)合兔纖維環(huán)和髓核細(xì)胞，構(gòu)建一體化組織工程椎間盤。

3.3 一體化支架的理化特性 理想的組織工程支架應(yīng)具備合適的孔徑、孔隙率以及高度連通的孔結(jié)構(gòu)，以滿足種子細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、浸潤(rùn)和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。本研究以絲素蛋白為材料，采用石蠟致孔法和相分離法，經(jīng)冷凍干燥構(gòu)建一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架。結(jié)果顯示纖維環(huán)相孔徑適宜，孔隙率均較高；顯微鏡觀察可見雙相結(jié)構(gòu)均具有高度連通的孔隙結(jié)構(gòu)，并且在沒有交聯(lián)的情況下，交界區(qū)結(jié)合緊密牢固；這些指標(biāo)均達(dá)到了理想支架材料的基本要求。椎間盤是一個(gè)復(fù)雜的受力組織器官，其對(duì)力學(xué)性能要求較高［17］。本實(shí)驗(yàn)中研究的絲素蛋白一體化支架經(jīng)壓縮測(cè)試，測(cè)得其壓縮彈性模量為（150.7± 6.8）kPa，其在高度連通、較高的孔隙率的情況下，仍具有優(yōu)越的力學(xué)性能，滿足椎間盤移植早期的力學(xué)支撐的基本要求［18］，并且顯著優(yōu)于膠原蛋白、脫細(xì)胞基質(zhì)等支架材料。盡管其壓縮模量仍低于人正常天然椎間盤（238.7±68.0）kPa，但是其力學(xué)性能將會(huì)隨著長(zhǎng)期的細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌聚集及適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激而逐漸增加，達(dá)到天然椎間盤的水平［19］。

3.4 一體化支架的細(xì)胞相容性 本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞-支架復(fù)合物體外培養(yǎng)48 h后，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)2種細(xì)胞呈球狀或短梭形均勻黏附于支架表面，表明支架有利于種子細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)和基質(zhì)分泌。Live/ dead染色結(jié)果和CCK-8增殖分析顯示2種均能保持良好的生長(zhǎng)活性，并且均具有良好的增殖活性，這可能是由于一體化絲素蛋白支架沒有有毒試劑的殘留，無細(xì)胞毒性，具有優(yōu)越的生物相容性，是組織工程纖維環(huán)-髓核的理想支架載體。

綜上所述，采用石蠟致孔法和相分離法構(gòu)建的一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架可以作為組織工程椎間盤支架，為構(gòu)建一體化組織工程椎間盤提供了新的方向。但組織工程復(fù)合物在動(dòng)物體內(nèi)的生物功能、與周圍組織的整合情況以及支架的降解情況仍需進(jìn)一步研究。

（圖2～4見插頁）

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（2014-12-28收稿 2015-01-21修回）

（本文編輯 李鵬）

Manufacture and evaluation of integrated biphasic silk fibroin scaffold made by annulus fibrosus-nucleus pulposus tissue engineering

DU Lilong1，2，XU Baoshan2△，YANG Qiang2，MA Xinlong2，LI Xiulan，ZHANG Yang2，GUO Yue2，DING Xiaoming1，2，QI Jizhou1，2，ZHAO Jianing1，2
1 Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Tianjin Hospital
△Corrsponding Author E-mail：xubaoshan99@126.com

Objective To assess the prospect of integrated biphasic silk fibroin scaffold made by annulus fibrosus-nucleus pulposus tissue engineering in application as integrated intervertebral disc（IVD）.Methods An integrated annulus fi brosus-nucleus pulposus（AF-NP）biphasic scaffold was made by silk fibroin using two different uncomplicated methods which were paraffin spheres-leaching method（outer AF phase）and phase separation method（inner NP phase）.The scaffold was investigated by general observation，stereomicroscope and scanning electron microscopy（SEM）.Its pore size，porosity，and compressive elastic modulus were determined.AF and NP cells were isolated from rabbit IVD and seeded into the corresponding phase of the scaffold respectively.The cell-scaffold complex was cultured for 48 hours.The biocompatibility of the scaffold was evaluated by SEM，live/dead staining while CCK-8 assay was used to assess cell proliferation.Results Stereomicroscope and SEM showed that AF phase and NP phase integrated perfectly without cross-linking.Both phases possessed highly interconnected porous structure［pore size of AF and NP phase were（220.0±23.1）μm and（90.0±17.8）μm，respectively］and highly porosity（AF and NP phase were respectively 91%and 93%）.In addition，this silk biphasic scaffold had impressive mechanical properties（150.7±6.8）kPa.SEM revealed that disc cells attached to regions of pore walls，distributed uniformly and secreted extracellular matrix.Live/Dead staining and cell count kit-8（CCK-8）analysis showed that the silk composite scaffold was non-cytotoxic to disc cells.Conclusion This silk biphasic AF-NP scaffold has satisfied pore size，porosity，biomechanical properties and biocompatibility，so it is ideal candidate for IVD tissue engineering.

tissue engineering；silk；intervertebral disk；scaffold；annulus fibrosus；nucleus pulposus

R318.17，R329-33

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.007

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81272046，31300798，31470937）；中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2011M500530，2012T50221）；天津市衛(wèi)生局攻關(guān)課題（14KG121）

1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（郵編300070）；2天津市天津醫(yī)院

杜立龍（1988），男，碩士在讀，主要從事脊柱外科、組織工程椎間盤研究

△E-mail：xubaoshan99@126.com