張　嶺，蔣　巖，潘品良

HIV-1病毒載量檢測常用技術及研究進展

張嶺，蔣巖，潘品良

病毒載量檢測是HIV-1感染后需要長期觀察的重要指標，在基礎研究、早期感染的診斷、藥物治療學研究和流行病學監(jiān)測方面都有特殊的意義。目前普遍使用的HIV病毒載量檢測主要是測定血漿中病毒RNA的量，采用的方法包括熒光定量PCR技術、核酸等溫擴增技術以及分支DNA雜交技術等。檢測的樣本包括血清、分泌物及全血制備的干血斑等多種類型，檢測的靶點也會涉及到細胞基因組中整合的病毒DNA的應用。反轉錄酶法檢測技術和其他等溫擴增技術等許多技術已用于實驗檢測，一些交叉學科技術正進行著實驗性探索。我國已有HIV-1病毒載量檢測實驗室140余家，3種經典的檢測技術均有涉及。各種技術特點不同，但在病毒載量檢測工作中均發(fā)揮巨大的作用。

HIV-1；病毒載量；分支DNA信號擴增試驗；綜述

據WHO統(tǒng)計，2013年全球有970萬HIV感染者接受抗病毒治療（antiretroviral therapy，ART），至2015年底預計有1500萬感染者將接受ART［1］。參照美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)布的指導原則，中國制訂了《艾滋病治療手冊》，規(guī)定接受治療的感染者必須定期檢測血漿中HIV-1 RNA水平（病毒載量），以反映藥物療效，預防耐藥的發(fā)生。當接受ART后病毒載量＞200copies/ml時可認為治療失敗，須調整治療方案［2］。

如上所述，目前病毒載量檢測的靶點一般為RNA，檢測試劑包括羅氏診斷的 Cobas AmpliPre/Cobas TaqMan HIV-1 Testv 2.0、雅培公司的RealTime HIV-1、梅里埃公司的NucliSens EasyQ HIV-1 v2.0及和西門子公司的Versant HIV-1 RNA 3.0 assay（b-DNA）。除此以外，Cavidi公司還開發(fā)了以反轉錄酶為靶點的病毒載量檢測試劑exavir load。近年國內基于實時熒光定量技術與不同的核酸提取方法進行研制，凱杰、達安基因、東北制藥、寶瑞源、珠海麗珠與萬泰生物等企業(yè)研制開發(fā)了國內的HIV-1病毒載量檢測試劑盒。

1　樣本類型

HIV載量檢測的待測樣本通常為血漿?？紤]到肝素是Taq酶的抑制劑，目前已上市的多個病毒載量檢測試劑在使用時應避免用肝素抗凝，一般使用EDTA作為抗凝劑。另外，血清樣品也可用于測試，但同一患者的血清和血漿樣品同時檢測時，血清的病毒載量結果會略低于血漿樣品檢測結果。

針對HIV的性傳播特性，研究表明精液中的病毒載量與血漿病毒載量存在正相關關系，且前者略低于后者［3-4］，但也有部分感染者精液病毒載量會高于血漿，可能是受生殖道內免疫功能的影響。而受陰道內酸性環(huán)境的影響，HIV女性感染者陰道分泌物中的病毒含量值變化很大［5］。另外，唾液中也可檢出HIV，但數(shù)值大大低于血漿病毒載量結果。

針對全血樣品，目前應用最多的是干血斑這種處理方式。2010年3月，WHO發(fā)布了使用干血斑樣本作為替代樣本進行HIV耐藥檢測的操作手冊［6］。2014年，Smit等［7］總結了以往的13項研究，提出使用干血斑進行病毒載量檢測時，若檢測限定為1000 copies/ml，靈敏度為78%～100%；若檢測限定為5000 copies/ml，靈敏度可提升至100%。另外，因為血漿病毒載量只檢測游離病毒，而干血斑檢測細胞內RNA及整合入染色體的病毒前體DNA，所以還存在假陽性問題，影響對抗病毒治療的監(jiān)測［8］。

2010年開始，美國疾病預防控制中心針對HIV病毒載量檢測推行一種實驗室能力驗證系統(tǒng)，它所下發(fā)的考核樣品為干血管（dried tube specimens，DTS）［9］。該樣品類型室溫條件下可穩(wěn)定8周，且沒有傳染性，所以對運輸條件沒有嚴格要求。另外，復溶之后，現(xiàn)有的病毒載量檢測系統(tǒng)均可對該類型樣本進行檢測。所以DTS可替代傳統(tǒng)的液態(tài)血漿標本完成實驗室能力驗證工作，但由于其制備流程復雜，還不能大規(guī)模用于常規(guī)的病毒載量檢測［10］。

2　HIV-1病毒載量檢測技術

HIV-1病毒載量檢測方法有多種原理，常用的包括核酸等溫擴增、實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）、分支DNA技術、非核酸的酶法檢測等，另外很多交叉學科也在HIV檢測方面進行了試驗型探索。分別介紹如下。

2.1核酸等溫擴增技術目前核酸等溫擴增技術主要有4種，解旋酶依賴性擴增［11］、環(huán)介導等溫擴增［12］、核酸序列依賴性擴增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）和重組酶聚合酶擴增［13］，均在HIV病毒載量檢測中有不同程度的應用，其中應用最為成熟的是NASBA技術。

1991年，Cangene公司的Compton［14］在Nature上刊文，介紹了NASBA技術。該技術可以與其他很多技術結合，實現(xiàn)診斷的目的。Mollasalehi和Yazdanparast［15］用納米金檢測NASBA擴增產物，獲得良好效果。Zhao和Dong等［16］將NASBA技術與芯片技術結合，可同時檢測一個樣本的多個指標。2002年，生物梅里埃公司Weusten等［17］將分子信標與NASBA技術相結合，建立了實時檢測體系，并且推導出相應的病毒載量計算公式，形成NucliSENS EasyQ HIV-1病毒載量檢測試劑盒。2005年，在一項有4個實驗室參加的多中心評價中，該試劑盒的線性、特異性和重復性與當時已上市的病毒載量試劑盒沒有明顯區(qū)別，且對于非B亞型和O亞型檢測效果更好［18］。

由于NASBA技術為RNA擴增，不會受基因組DNA的影響，所以在很多研究中將EasyQ試劑與干血斑采樣方式相結合，用于偏遠地區(qū)的抗病毒治療監(jiān)測，取得良好效果。Mercier-Delarue等［19］發(fā)現(xiàn)，針對干血斑樣品，實時PCR方法的特異性為58/70，而NASBA技術的特異性為95/97，很明顯NASBA由于可排除染色體DNA干擾特異性更高。

2.2實時熒光PCR技術1996年，Heid等［20］在Genome Research上發(fā)表文章，詳細說明了TaqMan探針、實時熒光PCR以及基于此的核酸定量原理和計算公式，形成了第二代PCR技術。目前很多公司以實時熒光定量PCR為基礎，開發(fā)出HIV病毒載量診斷試劑。有代表性的包括羅氏公司的Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1 test（CAP/CTM）以及雅培公司的m2000 real-time HIV assay。

羅氏公司的CAP/CTM 1.0試劑采用標準的TaqMan探針技術，隨著應用越來越多，發(fā)現(xiàn)該試劑的亞型覆蓋不夠全面，另外其靈敏度較差，容易出現(xiàn)假陰性結果［21］。針對這些問題羅氏公司對試劑進行了改進，推出CAP/CTM 2.0，在原來gag區(qū)靶基因的基礎上增加一段3'-UTR區(qū)序列作為靶基因，收到良好的效果。雅培公司的HIV-1 assay與羅氏公司產品相類似，只是其靶基因選在pol基因的整合酶片段內。另外檢測下限也有所不同。

上述兩套系統(tǒng)均采用全自動設備，利用磁珠吸附的原理完成核酸提取，所以設備成本高、尺寸大、運行時間長。而臨床需要快速簡便的病毒載量檢測方法，針對這一需求，很多公司開發(fā)出以PCR為原理的POCT系統(tǒng)。例如羅氏的Cobas Liat系統(tǒng)以及Alere公司的Alere q HIV analyzer，都是將樣本核酸提取和擴增過程集中到一塊微流樣本卡上，在特定儀器上完成擴增后直接讀數(shù)，方便快捷。

目前，很多國內廠家也利用實時熒光PCR技術開發(fā)出HIV-1病毒載量檢測試劑。已通過國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊認證的HIV病毒載量檢測試劑有6個（表1）。

表1　國產HIV-1病毒載量檢測試劑Table 1　Domestic HIV-1 viral load testing kits

2.3分支鏈DNA信號放大技術（branched DNA，bDNA）bDNA技術是Chiron公司開發(fā)出的檢測技術，于1993年首先用于HIV檢測。該技術的優(yōu)點是不需要核酸提取過程，不需要反轉錄及PCR擴增，并且對樣品要求低，溶血樣品和福爾馬林固定過的組織樣品也可以檢測。Versant HIV-1 RNA 3.0 assay是西門子公司基于bDNA原理的產品，由于該技術不依賴于核酸擴增，所以受擴增條件的影響小。體現(xiàn)在檢測結果上，低載量的樣品檢測結果的重復性優(yōu)于PCR方法，適用于用藥患者病毒載量的監(jiān)測。

2.4非核酸檢測技術ExaVir Load是瑞典Cavidi公司開發(fā)的HIV-1病毒載量檢測試劑盒，該試劑盒不是以核酸為檢測靶點，而是以病毒的反轉錄酶為靶點，用特殊的底物檢測樣品中反轉錄酶的活性來折算病毒載量。由于不涉及核酸，所以該方法可覆蓋各種亞型，并且也不需要復雜的儀器設備。Huang等［22］于2010年收集了87例患者的215份樣品，對ExaVir Load第2版和第3版進行了評價，以羅氏Cobas TaqMan系統(tǒng)為參照。結果顯示ExaVir Load 第3版的檢出率為95.3%，檢測結果與羅氏結果相關系數(shù)為0.95。

2.5探索性的研究技術在多項探索性研究中，人們將分子生物學技術、生物傳感器技術及納米技術相結合，應用于HIV病毒檢測中。Sun等［23］將外切酶介導的目的片段循環(huán)技術與銀離子探針相結合，通過檢測游離銀離子濃度實現(xiàn)HIV DNA的檢測。Shafiee等［24］設計了一種具有納米結構的光子晶體，在晶體上連接特異的抗體直接捕獲生物樣本中的完整HIV-1病毒顆粒，通過反射光波長的偏移檢測HIV-1病毒載量。Yan等［25］用光子點聚合物作為示蹤劑，以氧化鐵微球作為捕獲劑，兩者均標記寡核苷酸鏈，與HIV DNA互補結合，以光子點的量計算病毒載量。上述方法由于還處在試驗階段，靈敏度均在105copies/ml左右，還遠沒有達到臨床要求。

3　方法學比較

不同方法因原理不同，在檢測過程中各有其特點。下面就國內常用病毒載量檢測方法的靈敏度、特異性、重復性和定值進行比較。

3.1靈敏度目前國內常用的HIV-1病毒載量檢測試劑的檢測下限見表2。單純從檢測下限看EasyQ的靈敏度最高，bDNA的靈敏度最低，這與文獻報道的略有不同。2005年，de Mendoza等［18］在對EasyQ進行試劑評價時完成了2項試驗，在121例樣品的試驗中，Amplicor的檢出率為94%，EasyQ的檢出率為91%；113例樣品的試驗中bDNA的檢出率為51%，而EasyQ的檢出率為68%。2007年，Holguín等［26］收集了83例非B亞型或重組型HIV感染者的血漿，分別用bDNA、CAP/CTM和EasyQ測定病毒載量，評價3種試劑對低值樣品的檢測能力。結果顯示接受抗病毒治療的28例樣本3種方法結果均為陰性，而其余55例原始患者bDNA、CAP/ CTM和EasyQ檢測呈陰性的比例分別為20.0%、14.6%和32.7%。這2項研究中Amplicor或CAP/ CTM（反轉錄PCR方法）的靈敏度最高。

表2　不同試劑主要性能指標Table 2　Comparison of main performance of current HIV-1 viral load testing kits

3.2特異性各種試劑均有提高其特異性的設計，例如CAP/CTM試劑采用UNG酶-dUTP系統(tǒng)，可以預防環(huán)境中之前的擴增產物對本次檢測的影響。bDNA試劑的預雜交探針中有一部分包含非天然核苷（isoC、isoG），該部分探針可以去除非特異性結合，提高信號/噪聲比。EasyQ試劑本身就是RNA擴增方式，可以去除血漿中殘留的DNA（如外泌體DNA）對擴增的干擾。

3.3重復性病毒載量檢測的主要目的之一就是對接受抗病毒治療的患者進行監(jiān)測，評價藥物療效、預防耐藥發(fā)生、監(jiān)控患者病情發(fā)展。而這部分患者的血漿病毒載量一般都很低或小于檢測限，所以評價試劑對低載量樣品的檢測重復性非常有意義。普遍認為bDNA方法檢測結果的穩(wěn)定性最好。Lubelchek等［27］比較了Amplicor和bDNA對低載量樣品的檢測能力，結果顯示Amplicor的變異系數(shù)為0.55，而bDNA的變異系數(shù)為0.19。

3.4定值本實驗室2007年利用國內樣品（主要為CRF_BC型）對早期的3種方法進行了評價，結果顯示同一樣品COBAS Amplicor Version 1.5（RTPCR，Amplicor）檢測得到的病毒載量值最高，其次為Versant HIV-1 RNA 3.0 assay（bDNA），而NucliSens HIV-1 QT（NASBA）得到的病毒載量值最低［28］。Pyne等［29］用包含9個亞型的血清盤對Cobas Ampli-Prep/Cobas TaqMan（CAP/CTM）、Amplicor以及bDNA 3種方法進行評價，結果顯示CAP/CTM和Amplicor的檢測結果明顯高于 bDNA。另外，在上文Holguín等［26］的工作中，EasyQ的檢測結果最高，平均為4.87 log10copies/ml，bDNA得到的結果最低，平均為4.16 log10copies/ml，相差0.7 log10copies/ml?？梢奲DNA的定值最低，推測可能的原因是bDNA體系中含有復雜的探針系統(tǒng)，樣品和標準品之間探針雜交效率的微小差異會直接影響最終計算得到的病毒載量值。

4　總　結

病毒載量檢測技術主要用于解決與HIV感染有關的理論和實際問題，包括病毒活性與病程的關系及病毒穩(wěn)態(tài)與預后的關系，在臨床試驗中對抗病毒藥物進行評價，可以在出現(xiàn)臨床癥狀之前開始用藥，在臨床癥狀發(fā)展之前判斷藥物治療是否失敗，評價治療方案的有效性等。

現(xiàn)在病毒載量檢測除了與抗病毒治療相結合以外，相關技術還可應用于不確定病例的診斷，特別是窗口期患者［免疫學檢測的窗口期為（19±2）d，而核酸檢測窗口期為（10±2）d［30］］以及晚期感染者（晚期患者抗原反應性衰減，檢測結果會呈現(xiàn)不確定型）的診斷。另外在血源篩查及高危人群的篩查方面，匯集方式的病毒載量檢測即可以縮短檢測窗口期，提高靈敏度，如果策略得當?shù)脑掃€可以降低檢測成本。

隨著HIV病毒載量應用的普及，檢測技術也有了長足的進步，但總體上有以下幾個發(fā)展方向。第一，實時熒光檢測技術成為主流，該技術由于成本低、操作簡單、技術積累豐富等優(yōu)點，在病毒載量檢測中發(fā)揮越來越大的作用。目前國內廠家的病毒載量檢測試劑均是基于實時PCR技術開發(fā)的，其他技術例如分支DNA技術已逐步退出載量檢測領域。第二，檢測設備趨向于一體化，或者是大型的全自動設備完成樣本處理和檢測，或者發(fā)展成小型的POCT產品，而核酸等溫擴增技術由于對反應條件要求很低，最有希望開發(fā)成POCT產品。第三，由于抗病毒藥物的使用，多數(shù)HIV-1感染者血漿中的病毒會得到控制，表現(xiàn)為經典的病毒載量檢測結果小于檢測下限，此時為了更好地評價治療效果，細胞基因組中整合的HIV成為研究熱點，它的水平高低決定著患者預后。目前不是所有試劑都可以檢測病毒DNA，相關檢測標準和檢測策略還有待完善。

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（2015-10-10收稿2015-11-17修回）

（責任編委曲芬本文編輯盧福昱）

Current techniques and research progress of HIV-1 viral load testing

ZHANG Ling，JIANG Yan，PAN Pin-liang*National Center for AIDS/STD Control and Prevention，China Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China *Corresponding author，E-mail:panpinliang@chinaaids.cn

Viral load testing is a pivotal measurement of HIV-1 infections，and is meaningful in fundamental research，diagnosis of acute infection，therapeutic research as well as epidemiological monitoring.Classical HIV viral load testing refers to the measurement of viral RNA by techniques such as real-time PCR，isothermal amplification of nucleic acid，or branched DNA hybrization.Sample candidates cover serum，discharge and dried whole blood spots，and consequently，the testing target expands to pro-viral DNA integrated in the host genome.In addition，more and more techniques，including reverse transcriptase assay and new isothermal amplification，are applied in the testing，and interdisciplinary attempts are still under way.Presently，HIV-1 viral load testing is carried out in more than 140 laboratories in China，among which three cardinal techniques are applied.In spite of the different nature of the techniques，they all play an important role in HIV viral load testing.

HIV-1；viral load；branched DNA signal amplification assay；review

潘品良，E-mail:panpinliang@chinaaids.cn

10.3969/j.issn.1007-8134.2015.06.005

國家“十二五”科技重大專項（2012ZX10001001-001-002）

102206北京，中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心（張嶺、蔣巖、潘品良）