姚娟娟，楊　峰，黃東洪，汪順帆，張詠雪，陳龍甫

(三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶大學，重慶　400045)

· 試驗研究 ·

超聲波處理硅藻中細胞的完整性研究

姚娟娟，楊峰，黃東洪，汪順帆，張詠雪，陳龍甫

(三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶大學，重慶400045)

硅藻水華問題是目前三峽庫區(qū)亟待解決的一個重要問題，本文通過研究高低頻超聲波對硅藻的去除效果，利用簡單的手段——顯微鏡和TOC分析儀，對超聲波處理3種不同類型的硅藻進行分析。發(fā)現(xiàn)200kHz超聲的強烈機械振蕩作用對硅藻破壞效果較明顯優(yōu)于800kHz高頻超聲波。

超聲波; 細胞完整性; 針桿藻; 直鏈屬藻; 脆桿藻

三峽水利樞紐作為世界規(guī)模最大的水電工程，在為社會帶來防洪、發(fā)電、航運等工程效益的同時，由此引發(fā)的環(huán)境問題也不容忽視。截至目前，嘉陵江、漢江等三峽庫區(qū)次級河流多次發(fā)生水華[1～2]，其中硅藻水華問題尤為突出[3]，對硅藻水華的處理和預防刻不容緩。由于常規(guī)的處理工藝難以解決水華問題，超聲波技術(shù)作為一種環(huán)境友好型的水處理工藝開始逐漸發(fā)展起來[4]?，F(xiàn)階段國內(nèi)外已有眾多學者對應用超聲波處理藍綠藻水華進行了深入的研究[5]，但是針對超聲波在硅藻水華上的應用研究卻明顯滯后。硅藻和藍藻從粒徑大小到結(jié)構(gòu)形態(tài)存在著極大的差異[6]，硅質(zhì)的細胞壁結(jié)構(gòu)使其能夠保持良好的完整性[7]，因此一旦飲用水水源地硅藻水華爆發(fā)，將嚴重影響水處理工藝的效能[8]。除此之外，在滅活硅藻的過程中伴隨著胞內(nèi)有機物的釋放和降解[9]，對于水質(zhì)安全而言有一定隱患，目前尚無相關規(guī)律研究。藻細胞的完整性是滅活硅藻安全性一項重要指標。本實驗通過顯微鏡觀察在相同功率下，超聲波處理前后硅藻細胞形態(tài)的變化，對超聲波處理硅藻水華的可行性進行研究。

1　方　法

1.1試驗藻種及培養(yǎng)

實驗所用的淡水針桿藻(Synedra)、直鏈屬藻(Melosira)和脆桿藻(Fragilaria)來自中國科學院淡水藻種庫，3種藻單獨培養(yǎng)，采用AGP培養(yǎng)基[10]，在恒溫光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。恒溫光照培養(yǎng)箱運行參數(shù)為：溫度——20.0 ℃±1.0 ℃，光照強度——1500 Lux，光/暗周期——14h∶10h。實驗中所使用的針桿藻初始濃度為15～25×107cell/L。直鏈屬藻的濃度為15～18×107cell/L，脆桿藻濃度為60～70×107cell/L。

1.2分析方法

本實驗采用200kHz和800kHz兩個波段，采用相同的實際功率控制單一變量進行比較。

使用10×10倍放大顯微鏡通過血球計數(shù)板對藻細胞進行計數(shù)；使用10×40倍放大顯微鏡對藻細胞形態(tài)進行觀察。

本實驗中溶解性有機碳DOC(Dissolved Organic Carbon)采用德國元素分析系統(tǒng)公司的Liqui TOCⅡ測量，將超聲波處理后的藻液吸入針筒并用0.7um醋酸纖維濾膜過濾，將濾液用TOC分析儀測定。

超聲波功率采用焦耳熱量進行測定[11]。

1.3實驗方法

超聲發(fā)生器型號為SF200(226kHz)和 SF800(800kHz)，輸出電功率為0～120w可調(diào)(中科院聲學研究所東海站，上海)。超聲反應在一個開放的不銹鋼圓筒中進行[12]，實驗反應的溫度控制在20.0℃±1℃。為了便于研究，實驗中采用控制變量法對不同時間段下，超聲處理藻細胞的形態(tài)進行比較。統(tǒng)一采用生長在穩(wěn)定期的藻液200mL進行實驗。通過焦耳熱法測定實際功率為35W。

2　結(jié)果與討論

2.1顯微鏡觀察超聲波對藻細胞完整性的破壞

2.1.1針桿藻超聲波處理前后細胞完整性

如圖1(a)所示，天然情況下針桿藻中間寬兩頭窄，呈細長的針桿狀，當針桿藻被超聲波處理后，細胞中部容易受到超聲波攻擊，細胞器被破壞，胞內(nèi)物質(zhì)部分釋放出來，如圖1(b)。隨著超聲波處理時間增加，胞內(nèi)有機物釋放，細胞成為了空殼如圖1(c)所示。最終，針桿藻的硅殼被打碎，斷裂成2～3截的碎片如圖1(d)。

圖1　超聲波處理不同時間段針桿藻細胞形態(tài)變化Fig.1　The morphological changes of the synedra with ultrasound treatment time

以圖1(a)中細胞形態(tài)作為參考，統(tǒng)計不同處理時間段的具有完好細胞形態(tài)的針桿藻比例，得出了細胞形態(tài)的變化規(guī)律。通過控制時間作為單一變量，觀察在200kHz和800kHz頻率超聲波處理10min內(nèi)細胞形態(tài)的變化，將完整性不同的細胞分成四類：完整的針桿藻細胞如圖1中的(a)、細胞形態(tài)發(fā)生變化且細胞內(nèi)物質(zhì)部分被釋放出來的細胞如圖1中的(b)、僅剩硅質(zhì)空殼的細胞如圖1(c)、完全破碎的空殼如圖1(d)。由于細胞碎片的數(shù)量無法統(tǒng)計，在分析細胞形態(tài)時最后一種細胞形態(tài)不納入統(tǒng)計，做出各個細胞形態(tài)占總細胞的比例以及這3種細胞的總個數(shù)，如圖2所示。

從圖2(a)中可以看出，在200kHz超聲波處理2min之后，細胞濃度由17.1×107cell/L 下降到6.0×107cell/L ，65%的細胞直接被打碎到圖1(d)所示的形態(tài)。在仍保持細胞形態(tài)的的35%的針桿藻細胞中：胞內(nèi)物質(zhì)伴隨著細胞變形而逐漸開始釋放，59%細胞形態(tài)發(fā)生變化，如圖1(b)，35%細胞受到超聲波的攻擊比較嚴重，胞內(nèi)物質(zhì)釋放完全，細胞變成空殼，如圖1(c)。6min時雖然各個細胞形態(tài)的細胞在顯微鏡視野下比例變化不大，此時的細胞濃度為3.4×107cell/L，80%的細胞已經(jīng)被打成碎片。6min之后由于細胞濃度較低，超聲波對藻細胞的攻擊的同時還會對細胞空殼以及細胞碎片進行攻擊，導致細胞碎片進一步被打碎。因此，200kHz頻率的超聲處理時間不宜超過6min，一方面是由于胞內(nèi)有機物的釋放對水質(zhì)造成影響，另一方面從水處理工藝的角度考慮，將粒徑較大的細胞打碎以后將更難沉淀下來。

圖2　各形態(tài)細胞所占比例隨超聲波處理時間變化Fig.2　Change of the proportion of different kinds of cells with sonication time using the frequencies of 200kHz and 800kHz

圖3　200kHz和800kHz超聲波處理針桿藻細胞去除率隨時間變化Fig.3　Bacterial cell removal by the frequencies of 200kHz and 800kHz

同理， 800kHz下的各個細胞形態(tài)所占比例隨時間的變化折線圖如圖2(b)所示。在超聲波處理初期，細胞濃度較大，其破壞較明顯，在前2min，細胞濃度由17.1×107cell/L 下降到12.6×107cell/L，26%的細胞在超聲波作用下變成碎片。在74%的細胞中，42%的細胞變形，36%的細胞變成空殼。在2～10min，細胞濃度由12.6×107cell/L 下降到10.3×107cell/L，細胞濃度下降不到20%，在此階段超聲并未直接將細胞打成碎片，而空殼細胞的比例在不斷上升，由36%上升到67%，超聲波主要作用是將細胞變成碎片但其細胞形態(tài)仍然得到保持。

形態(tài)完好的細胞在800kHz超聲波處理下折線圖的總體走向與200kHz基本相同，但是在800kHz超聲處理6min之后，800kHz仍有19%的細胞形態(tài)完好，而200kHz已經(jīng)不存在形態(tài)完好的細胞；800kHz下僅26%的細胞被打成碎片；而200kHz在超聲處理同樣時間，有80%的細胞被打成碎片。在超聲波處理6min時，800kHz空殼細胞的比例為56%，而200kHz空殼細胞比例僅為42%，由于200kHz時超聲波破壞主要是使得細胞濃度下降(即細胞被打成碎片)，而800kHz時超聲波破壞主要將細胞變成空殼而不將其破碎。

超聲波對細胞的作用，無論是將其打成空殼或者是碎片，細胞內(nèi)部細胞器已經(jīng)完全破壞，通過統(tǒng)計800kHz和200kHz的細胞去除率(即空殼細胞和破碎細胞的總和與總細胞數(shù)的比值)，如圖3所示。在200kHz超聲作用下，超聲波處理4min時細胞去除率達到80%，而800kHz則要到10min才能達到80%的細胞去除率，可見800kHz對藻細胞的破壞效果遠不及200kHz。

因此，從藻細胞的破壞的角度相比較而言，200kHz頻率的超聲波比800kHz對藻細胞處理更有效，更徹底。從實驗過程中觀察到在相同功率下，200kHz的超聲主要為機械振蕩作用，在超聲處理過程中液體間強烈碰撞，產(chǎn)生摩擦力和剪切力將藻細胞打碎。800kHz相對而言比較溫和。這一點上與Wu等人對微囊藻的研究結(jié)果相吻合，低頻比高頻超聲波處理具有更好的效果[13]。

2.1.2多細胞硅藻超聲波處理前后細胞形態(tài)

通過觀察直鏈屬藻和脆桿藻這兩種多細胞藻，在800kHz的超聲波處理過程中發(fā)現(xiàn)多細胞藻被超聲波破壞的過程與單細胞藻(針桿藻)有明顯的不同。脆桿藻和直鏈屬藻為多細胞形態(tài)，是由多個單細胞串成，在超聲波處理下，首先細胞連接處受到攻擊，多細胞逐漸裂解成單細胞。隨后，單細胞繼續(xù)受到破壞，釋放出胞內(nèi)的物質(zhì)，變成空殼，圖4分別表示了直鏈屬藻(a)和脆桿藻(b)在超聲處理下的破壞路徑。

鏡檢結(jié)果顯示，在超聲波處理的初期直鏈屬藻和脆桿藻結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，但結(jié)構(gòu)變化又略微的有些不同。從直觀的顯微鏡下的細胞形態(tài)變化可以看出來，直鏈屬藻遭到超聲作用而導致細胞連接處斷裂具有隨機性，其斷裂部位處于細胞中部和細胞首尾的概率相同。而脆桿藻細胞破碎部位則大多數(shù)位于脆桿藻細胞的首尾，這是由于兩種細胞的連接方式不同：脆桿藻連接部位的接觸面積較大，其中間部分受到兩端相連細胞的保護；直鏈屬藻接觸面積小，則各個部位受到超聲波攻擊的可能性相等。

參考Purcell等人[14]對長鏈多細胞破壞形態(tài)的定義：將有10個及10個以上的細胞相連直鏈屬藻如圖4(a)中的第一幅圖定義為完整的細胞；斷裂指的是圖4(a)第二幅圖的細胞形態(tài)，長鏈細胞連接處斷裂分散成十個以下的細胞；完全破碎則是圖4(a)的第三幅圖的形態(tài)(還有極少部分細胞破壞形態(tài)介于3種之間的，則不做具體分析)。

圖4　超聲處理不同時間段藻細胞形態(tài)變化Fig.4　The morphological changes of the Fragilariaceae(a)and Melosira sp.(b) cells with different ultrasound treatment time

圖5　各形態(tài)細胞所占比例隨超聲處理時間變化Fig.5　Change of the proportion of different cell forms with sonication time using the frequencies of 200kHZ(a) and 800kHz(b)

圖5(a)為直鏈屬藻細胞在800kHz超聲波處理不同時間后在顯微鏡下的各細胞形態(tài)——完整、破碎、裂解所占比例隨超聲波處理時間變化曲線。直鏈屬藻在前20min，細胞濃度維持在15～18×107cell/L，在30min時細胞濃度下降到9～10×107cell/L，因此在前20min可視為細胞濃度基本不變，細胞碎片較少。從圖表中看出，10min后呈多細胞形態(tài)的連接完整的直鏈屬藻細胞比例占所有細胞的6%，15min后顯微鏡視野里呈多細胞形態(tài)的直鏈屬藻被全部破壞。連接完整細胞的比例下降而斷裂細胞的直鏈屬藻在前10min數(shù)量增加迅速，且破碎細胞數(shù)量在前10min增加不明顯，這說明了在超聲波破壞的初期，超聲波的主要破壞部位在于藻細胞的連接處。在10min之后，長鏈的直鏈屬藻已經(jīng)基本斷開，此時超聲波破壞由細胞連接處轉(zhuǎn)向細胞個體。此外，通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：超聲波處理30min后，斷裂細胞和破碎細胞所占比例相近。但與800kHz針桿藻破壞過程不同的是：針桿藻細胞濃度下降較快而直鏈屬藻在超聲處理30min時細胞濃度僅下降30%～40%；針桿藻在前10min內(nèi)細胞破碎嚴重，而直鏈屬藻在前10min細胞破碎比例維持在20%±5%，在10min后破碎細胞所占比例才開始明顯增加。

圖5(b)為直鏈屬藻細胞在200kHz超聲波處理不同時間后在顯微鏡下的各細胞形態(tài)——完整、破碎、裂解所占比例隨超聲波處理時間變化曲線。未處理的直鏈屬藻，細胞濃度維持在17×107cell/L。在超聲波處理5min時，低頻的超聲波將長鏈的細胞打斷，并且伴隨有部分細胞破碎。在5～15min時，斷裂的細胞數(shù)目減少，而破碎的細胞數(shù)目增多，此階段斷裂的細胞被超聲波進一步打碎。在15min之后，顯微鏡下各形態(tài)細胞比例基本不變。800kHz超聲波對單細胞和多細胞的藻類處理效果差異較大，而200kHz下，兩種超聲波對藻細胞的破壞則比較類似。

相比于單細胞針桿藻，800kHz超聲波對多細胞直鏈屬藻的破壞效果并不明顯，這是由于直鏈屬藻藻細胞比表面積小，在超聲波作用在更容易維持其形態(tài)。Purcell在實驗中使用864kHz對四種不同類型的藻處理30min后發(fā)現(xiàn)，直鏈屬藻處理效果最不好；這是因為直鏈屬藻沒有氣囊，而高頻的超聲波對藻細胞的破壞主要針對氣囊。此外，低頻超聲波具有很強的機械剪切效應，能夠?qū)⒐栀|(zhì)細胞壁打碎[15]；而高頻超聲波的主要作用是將細胞連接處打碎[16]。因此，800kHz的高頻率對多細胞的直鏈屬藻的抑制效果并不佳，而200kHz的低頻超聲波強烈的機械振蕩作用可以在15min將直鏈屬藻細胞破碎。而超聲波對直鏈屬藻的破壞效果不如對針桿藻的破壞效果好，是由于細長的針桿藻抵抗剪切能力更弱，而圓柱形的直鏈屬藻相比于針桿藻更短小，抵抗剪切能力更強，所以消耗的時間更長。從能量輸出的角度看，800kHz超聲波處理時間過長，能量輸入較多，效率較低；200kHz超聲波破壞效果較好，且細胞破碎后沒有恢復能力。

2.2有機物的釋放

2.2.1針桿藻有機物釋放

通過顯微鏡觀察在200kHz和800kHz頻率下，超聲波處理5min，針桿藻的破壞效果明顯,其去除率分別達到83%和67%。圖6是用200kHz和800kHz超聲波處理15min內(nèi)DOC的變化，從圖線走向看出隨著超聲處理時間的增加，水樣中的可溶解有機物濃度逐漸增高。在超聲波處理前5min，200kHz明顯比800kHz釋放的有機物更多；這是由于在前5min，針桿藻細胞的破壞的比例200kHz比800kHz多16%，胞內(nèi)有機物釋放劇烈。而5min之后有機物釋放速率明顯降低的同時超聲的去除效率也降低。10min之后80%以上的藻細胞已經(jīng)受到嚴重破壞被打成空殼或者破碎，胞內(nèi)有機物釋放速率進一步減緩的同時去除效率降低。

在前5min，200kHz下，每個細胞釋放的有機物為0.399×10-7mg/cell；800kHz下，每個細胞釋放的有機物為0.597×10-7mg/cell。在5～10min，200kHz下，每個細胞釋放的有機物為1.14×10-7mg/cell；800kHz下，每個細胞釋放的有機物為1.39×10-7mg/cell。在200kHz，每去除單個細胞釋放的有機物釋放量小于800kHz；在前5min，去除單個細胞釋放的有機物小于5～10min時單個細胞釋放的有機物。因此，超聲波處理時間不宜過長，否則一來藻細胞去除率沒得到明顯改善，會造成能量的浪費，二來會導致水樣中有機物濃度增加，為后續(xù)水處理工藝帶來風險。

圖6　不同超聲處理時間下針桿藻DOC隨時間變化Fig.6　The DOC of synedra concentration under different sonication time using the frequencies of 200kHz and 800kHz

2.2.2直鏈屬藻有機物釋放

圖7是直鏈屬藻在200kHz和800kHz下可溶解性有機物隨超聲波處理時間變化圖。從圖中數(shù)據(jù)可以看出，在800kHz超聲波處理前10min內(nèi)，可溶解性有機物濃度變化不大。這再一次證明在前10min內(nèi)直鏈屬藻受到的主要破壞是細胞連接處斷裂，胞內(nèi)有機物釋放較少。隨著超聲處理時間增加，水樣中的可溶解性有機物含量也增加；10min之后胞內(nèi)物質(zhì)逐步開始釋放，單個藻細胞開始被破壞。而200kHz超聲波處理過程中，前10min內(nèi)DOC增加明顯，這是由于強烈的機械振蕩作用讓細胞破碎，胞內(nèi)物質(zhì)釋放，這進一步說明細胞連接處斷裂和細胞個體的破壞幾乎是同時發(fā)生的。

圖7　不同超聲處理時間直鏈屬藻DOC隨時間變化Fig.7　The DOC of molosira concentration under different sonication time using the frequencies of 200kHz and 800kHz

3　結(jié)　論

3.1在超聲波處理的過程中，單細胞針桿藻受到攻擊，細胞形態(tài)的完整性被破壞；800kHz對多細胞硅藻則是先連接處斷裂，后單個細胞完整性被破壞；而200kHz對多細胞硅藻破碎則是細胞連接處和細胞個體斷裂同時發(fā)生。

3.2不同頻率的超聲對硅藻細胞的破壞程度不同。由于硅藻細胞具有硅殼的保護，破壞硅藻需要更高的機械強度。隨著超聲頻率增加，超聲機械振蕩作用減弱，超聲對藻細胞破壞強度減少。通過實驗，發(fā)現(xiàn)200kHz超聲波對硅藻細胞破壞效果比800kHz破壞效果更明顯。

3.3超聲處理硅藻細胞造成胞內(nèi)有機物釋放，對水質(zhì)安全造成影響。超聲滅藻是一個漸變的過程，并不存在一個功率、頻率或超聲處理時間可以使藻細胞被破壞、而胞內(nèi)有機物不釋放。隨著超聲處理時間增加，胞內(nèi)有機物的釋放，對后續(xù)水處理工藝也會產(chǎn)生影響。因此，超聲處理參數(shù)的設定非常重要。

3.4超聲處理設定的參數(shù)選擇應隨硅藻細胞結(jié)構(gòu)的不同而不同，多細胞超聲波處理時間比單細胞超聲波處理時間長。

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Study on Cell Integrity of Diatom by Ultrasonic Treatment

YAO Juan-juan，YANG Feng, HUANG Dong-hong,WANG Shun-fan, ZHANG Yong-xue, CHEN Long-fu

(MinistryofEducationKeyLaboratoryofThreeGorgesReservoirArea&EcologicalEnvironment,ChongqingUniversity,Chongqing400045,China)

Diatom water bloom has become an urgent problem to be solved in the Three Gorges reservoir area. TOC analyzer and microscope were used to study the metabolic cell viability of three kinds of diatom by ultrasonic treatment at different frequencies-200 kHz and 800 kHz. The results indicated that ultrasonic treatment at lower frequency-200kHz led to cell lysis, while at higher frequency-800kHz, it was not as effective as that at lower frequency.

Ultrasound; cell integrity; Synedra; Melosira sp; Fragilariaceae.

2014-10-14

國家自然科學基金青年基金(51108481)；國家水體污染控制與治理科技重大專項(2012ZX07102001-003)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費資助(CDJRC11210002、106112012CDJZR210027)；污染控制與資源化國家重點實驗室開放課題資助(PCRRF12021)；重慶大學大型儀器設備開放基金資助。

姚娟娟(1982-)，女，四川隆昌人，2010年畢業(yè)于同濟大學市政工程專業(yè)，博士，講師，研究方向為水處理理論與技術(shù)。

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1001-3644(2015)02-0001-06