劉璟+孫洪圳+李保華+柏素花+祝軍+戴洪義

摘 要：通過調(diào)查接種后皮孔的發(fā)病率和病瘤直徑，鑒定了51份蘋果材料對枝干輪紋病的抗性，篩選出對輪紋病表現(xiàn)抗性的材料有雞冠、94-9-21、94-7-13、94-1-3、94-1-42、94-2-20、94-1-13、94-1-15和95-76;比較了不同抗性品種（系）一年生枝條的皮孔組織結(jié)構(gòu)和酚類物質(zhì)含量，抗病品種（系）的皮孔具有封閉層，皮層細胞層數(shù)多且排列緊密，皮層內(nèi)綠原酸含量顯著高于感病品種（系）。表明皮孔結(jié)構(gòu)和綠原酸含量與蘋果枝干對輪紋病的抗性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：蘋果輪紋病;皮孔;酚類物質(zhì)

中圖分類號：S661.103.4 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2015）06-0087-07

Resistance Identification and Mechanism Study of

Different Apple Varieties（Lines） to Botryosphaeria dothidea

Liu Jing1，Sun Hongzhen2， Li Baohua3， Bai Suhua1，Zhu Jun1， Dai Hongyi1*

（1.College of Horticulture， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China;

2.Comprehensive Service Station of Agriculture of Hutouya Town， Laizhou 261428， China;

3.College of Agronomy and Plant Protection， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China）

Abstract The burl diameter and disease incidence of lenticel were investigated after inoculation. The resistances of 51 apple materials to ?Botryosphaeria dothidea were identified. Jiguan， 94-9-21，94-7-13，94-1-3，94-1-42，94-2-20，94-1-13，94-1-15 and 95-76 were screened as resistant materials. The lenticel structures and phenolic compound contents of 1-year-old branches were compared among different cultivars（strains）.The lenticel of resistant cultivars （strains） possed closing layer with more layers of cortical cells arranged densely. The content of chlorogenic acid in cortex of resistant cultivars （strains） was higher than that of susceptible cultivars （strains）. It seemed to be that the lenticel structure and chlorogenic acid content in the cortex might be correlated with the resistance of apple branches to Botryosphaeria dothidea.

Key words Botryosphaeria dothidea; Lenticel; Phenolic compound

蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）危害蘋果果實和枝干，造成爛果和樹勢衰弱，是嚴重影響蘋果生產(chǎn)的重要病害之一。‘富士、‘紅星和‘金冠等主栽蘋果品種都易感染輪紋病，隨樹齡增大，危害加重[1]。培育抗病品種是防治蘋果病害的有效方法。篩選抗輪紋病蘋果資源和揭示蘋果對輪紋病的抗性機理對培育抗病品種具有重要意義。

通過田間自然發(fā)病調(diào)查和人工接種試驗來評價抗病性是篩選抗病資源最基礎(chǔ)和直觀的方法。在抗病性鑒定中，植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及一些次生代謝物質(zhì)經(jīng)常被用作抗性評價指標。比如，植物的角質(zhì)層、木栓層和蠟質(zhì)層等構(gòu)成了植物防御病原菌入侵的物理屏障。李廣旭等[2]首次證實皮孔是輪紋病菌最主要的侵入途徑。皮孔開裂早晚及有無完整充分木栓化的木栓組織，是決定蘋果品種對枝干輪紋病抗性強弱的主要因素[3，4]。同時，補充細胞和其下面的皮層細胞的層數(shù)以及排列緊密度也是阻礙病菌侵入和擴展的關(guān)鍵因素[5]。目前受傷植物體抵御病原體侵染反應中產(chǎn)生的酚類化合物[6]是抗病性研究的重點，其中阿魏酸、咖啡酸、綠原酸等都對微生物活性具有抵御作用，并抑制病原菌侵染植物體產(chǎn)生的細胞壁降解酶活性，從而提高植物抗病能力[7]。有研究表明綠原酸、表兒茶素類、根皮素配糖體、如根皮素-2′-木糖苷、3-羥基根皮苷、槲皮苷配糖體是蘋果多酚的主要功能成分[8]。趙曉芳[9]的研究也表明，在植物次生代謝物中，如沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、兒茶酚、單寧酸、蘆丁和香豆酸等酚類化合物都參與了抗病反應。植物抗病性與組織中總酚含量有相關(guān)性，如錐栗抗病品種樹皮和葉片中總酚含量都比感病品種高[10]。酚類化合物能影響細胞膜透性和ATP形成，也能被PPO和POD催化氧化形成醌類化合物，作為殺菌劑在植物抗病中發(fā)揮重要作用[11]。endprint

確定蘋果輪紋病抗性鑒定的組織結(jié)構(gòu)和生理生化指標，可提高雜種選擇效率，縮短育種周期。筆者擬在前人關(guān)于蘋果輪紋病抗性機制研究的基礎(chǔ)上，進一步研究確定較準確可行的抗性評價指標，用于篩選抗病種質(zhì)資源和雜交后代的早期選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 嫁接苗 本研究選取1994年雜交的國光（Ralls Jenet）×特拉蒙（Telamon）組合后代，1995年雜交的特拉蒙×新紅星（Starkrimson）、特拉蒙×嘎拉（Gala）和特拉蒙×富士（Fuji）組合后代和蘋果品種，共51份材料，于2010年4月6日嫁接到一年生長勢一致的八棱海棠上，每一雜種和品種各嫁接30株。

1.1.2 菌種來源 供試蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）從萊陽農(nóng)戶蘋果園中采集，寄主品種為富士。該菌種經(jīng)單孢分離純化后保存在青島農(nóng)業(yè)大學植物病害流行實驗室，標號為030101。

1.2 方法

1.2.1 枝條接種和調(diào)查方法 參照冷偉峰等[12]的方法，用輪紋病菌餅接種富士蘋果健康幼果誘導產(chǎn)孢，將表面長滿黑色孢子角的幼果在無菌水中浸泡10 min，使孢子充分釋放出來，用雙層紗布過濾，鏡檢濾液中的孢子濃度，配成1×105個/mL的孢子懸浮液，備用。

在青島農(nóng)業(yè)大學園藝實驗場內(nèi)，對一年生枝條于下午5點進行噴霧接種。接種前用棉球蘸取75%酒精涂抹待接種新梢，進行消毒。待酒精揮發(fā)徹底后，用1×105個/mL孢子懸浮液整枝噴霧接種，然后用30 cm×40 cm塑料袋套住新梢保濕15 h后解除。于2010年7月22日對51個品種（系）各接種3株，對照噴純凈水。

2010年11月5日統(tǒng)計噴霧接種發(fā)病部位5 cm長莖段內(nèi)的皮孔數(shù)和被侵染皮孔數(shù)，計算皮孔發(fā)病率;并測量該莖段內(nèi)10個病瘤的縱橫徑。

1.2.2 組織固定液、保存液和染色液的配制以及切片制作 組織固定液、保存液和染色液的配制參照張高雷等[13]的方法。于2011年7月28日，在青島農(nóng)業(yè)大學教學實驗場，選擇95-76、95-41、富士和雞冠4個品種（系）的2年生生長旺盛的幼樹10株，自樹冠外圍剪取發(fā)育充實的一年生枝條20枝，切取各品種枝條中部皮孔發(fā)育完全的皮層，經(jīng)12 h固定。以皮孔為中心，用手術(shù)刀片切取4 mm2皮層組織，經(jīng)4%瓊脂糖包埋，凝固后修成正方體小塊，用冷凍切片機（Microm HM 525）在-25℃下冷凍切片，切片厚度為8～12 μm。組織片滴加少許染色液30℃染色15 min，加蓋玻片，在Nikon H600L 生物顯微鏡下觀察，并選取典型視野拍照。

1.2.3 酚類化合物含量測定 樹皮中總酚含量測定采用福林酚法[14]，以標準溶液中的沒食子酸含量為橫坐標，以吸光度A為縱坐標做標準曲線，得線性回歸方程：y=0.1381x+0.011，R2=0.999。

樣品采集于2011年7月9日，在青島農(nóng)業(yè)大學教學實驗場，選擇國光、新紅星、嘎拉、雞冠、富士、95-76、95-42、95-41共8個品種（系）的2年生生長旺盛的幼樹，剪取樹冠外圍發(fā)育充實的一年生枝條5枝。蘋果樹皮的處理和酚類化合物的測定參照孫洪圳等[15]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工接種不同蘋果品種（系）發(fā)病情況比較

51份材料接種后均能誘導發(fā)病，發(fā)病率與病瘤直徑表現(xiàn)差異性較大。雞冠發(fā)病率最低，為39.01%，95-90發(fā)病率最高，達到93.58%，而對于病瘤直徑來說94-9-21皮孔感病后的病瘤直徑最小，為0.79 mm，94-5-31病瘤直徑最大，達到2.22 mm。 其中雞冠、94-9-21、 94-11-5、94-7-13和94-1-35這5份材料發(fā)病率較低，位于前5位，95-56、95-153、貴妃、95-41和95-90這5份材料發(fā)病率較高，位于后5位（表1）。51份材料中有15份發(fā)病率低于嘎拉（代號16），品種（系）代號1～15（圖1-a），而15份材料中有9份材料其病瘤直徑同樣比嘎拉小（圖1-b）。51份材料中有16份材料的發(fā)病率高于富士（代號35），品種（系）代號36～51（圖1-c），而16份材料中有4個材料其病瘤直徑同樣比富士大（圖1-d）。

綜合考慮皮孔發(fā)病率和病瘤直徑這兩個抗性指標，51份材料中表現(xiàn)為抗病的材料有雞冠、94-9-21、94-7-13、94-1-3、94-1-42、94-2-20、94-1-13、94-1-15和95-76;表現(xiàn)為高感的材料有特珍、95-177、95-56和95-90。

2.2 不同抗性蘋果品種皮孔組織結(jié)構(gòu)比較

如圖2所示，高抗品種雞冠木栓層充分木栓化，形成完整的封閉層，破裂的補充細胞殘留少，減少了病原菌生長所需的養(yǎng)分供應?？共∑废?5-76的封閉層破裂，但有7～10層排列緊密的皮層細胞。切片用0.1%苯胺藍乳酚油染色，可將細胞核染成藍色，而95-76的部分皮層細胞沒有染上藍色，推測其部分木栓化。易感病品系95-41皮孔開裂，有5～6層排列較緊密的皮層細胞，但開口下無排列緊密的封閉層，破裂的補充組織未完全脫落，殘留較多。高感品種富士沒有明顯的封閉層，皮層細胞排列疏松。

表1 不同蘋果品種（系）對枝干輪紋

病抗性鑒定結(jié)果

品種（系）代號 品種（系） 發(fā)病率（%） 病瘤直徑（mm）

1 雞冠 39.01 0.80

2 94-9-21 39.63 0.79

3 94-11-5 41.68 1.66

4 94-7-13 42.23 0.97

5 94-1-35 43.13 1.19

6 94-1-3 46.13 0.87endprint

7 94-1-42 48.19 1.05

8 94-2-20 50.50 1.03

9 94-1-13 50.60 0.80

10 95-75 51.32 1.22

11 94-1-15 54.26 0.85

12 94-1-26 56.52 1.27

13 新紅星 56.74 1.15

14 95-76 59.11 0.81

15 94-5-31 59.68 2.22

16 嘎拉 60.95 1.13

17 95-77 62.15 1.39

18 94-2-35 65.62 1.02

19 95-122 65.85 1.74

20 95-152 65.87 1.72

21 Tuscan 66.26 1.03

22 95-143 66.29 1.23

23 95-53 66.42 1.10

24 95-40 67.07 0.94

25 94-11-11 67.97 1.13

26 94-5-28 68.17 2.04

27 特拉蒙 68.36 1.34

28 95-22 69.25 1.49

29 95-21 69.79 1.23

30 Jan-95 70.14 1.16

31 95-136 70.55 1.16

32 7-c-19 70.59 1.61

33 95-42 70.92 1.89

34 95-118 71.07 1.10

35 富士 71.24 1.58

36 特珍 72.51 1.75

37 94-1-31 72.56 1.22

38 95-65 74.10 1.50

39 94-1-32 74.77 1.27

40 95-177 75.44 2.05

41 7-c-61 77.02 1.12

42 95-155 77.35 1.05

43 95-62 79.07 1.13

44 94-5-23 79.09 1.28

45 國光 79.35 1.08

46 95-79 82.05 1.17

47 95-56 84.12 1.58

48 95-153 86.42 1.29

49 貴妃 88.62 1.37

50 95-41 91.39 1.10

51 95-90 93.58 1.69

注：1～51即表1中品種（系）代號。a和c分別是以嘎拉（16）和富士（35）發(fā)病率為基數(shù)的相對發(fā)病率，即把嘎拉（富士）發(fā)病率賦予0，計算差值，負值代表發(fā)病率低于嘎拉（富士），正值代表發(fā)病率高于嘎拉（富士），相對值越大代表比嘎拉（富士）越低（高）。b和d分別是以嘎拉和富士病瘤直徑為基數(shù)的相對病瘤直徑，計算方法同相對發(fā)病率。

圖1 不同蘋果品種（系）的相對發(fā)病率和相對病瘤直徑

圖2 不同蘋果品種（系）皮孔組織結(jié)構(gòu)比較

2.3 不同蘋果品種（系）枝皮中酚類化合物含量比較

由表2 可知，8個蘋果品種（系）中都檢測到兒茶素、綠原酸、表兒茶素、香豆酸、蘆丁、根皮苷和根皮素，所有品種（系）都沒有檢測到?jīng)]食子酸、兒茶酚、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素。中抗品種嘎拉枝皮中兒茶素、綠原酸、表兒茶素、香豆酸和根皮苷都顯著高于其他品種（系）。高感品種（系）富士、95-41和95-42枝皮中綠原酸顯著低于嘎拉和雞冠。高感品種富士枝皮中表兒茶素

表2 不同蘋果品種（系）酚類化合物含量的測定結(jié)果

酚類

化合物

酚類物質(zhì)含量（mg/g）

嘎拉 95-41 國光 95-42 富士 雞冠 新紅星 95-76

沒食子酸 0 0 0 0 0 0 0 0

兒茶酚 0 0 0 0 0 0 0 0

兒茶素 0.037a 0.017b 0.016bc 0.015bcd 0.01bcd 0.012bcd 0.010cd 0.009d

綠原酸 0.061a 0.019f 0.024e 0.018f 0.026de 0.034b 0.032bc 0.03bcd

咖啡酸 0 0 0 0 0 0 0 0

表兒茶素 0.244a 0.188cd 0.187d 0.103f 0.083g 0.205b 0.121e 0.104f

香豆酸 0.580a 0.183d 0.238c 0.065h 0.087g 0.454b 0.140e 0.096f

阿魏酸 0 0 0 0 0 0 0 0

蘆丁 0.332a 0.226b 0.15d 0.163cd 0.131de 0.195bc 0.093e 0.227b

根皮苷 38.581a 21.806g 32.782b 27.887d 27.498e 29.624c 25.794g 27.214f

槲皮素 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c

根皮素 0.029b 0.023c 0.014f 0.042a 0.014g 0.017e 0.015f 0.022dendprint

和香豆酸都低于其他品種（系）。雞冠枝皮中綠原酸、表兒茶素和香豆酸都顯著高于富士。

2.4 不同蘋果品種（系）枝皮中總酚含量比較

抗病品種雞冠和嘎拉總酚含量顯著高于高感品種（系）富士、95-42和95-41，但是與中度感病品種國光差異不顯著?？共∑废?5-76總酚含量較低，顯著低于易感病的95-42和富士，與95-41差異不顯著（圖3）。

圖3 不同蘋果品種（系）枝皮中總酚含量

3 討論與結(jié)論

以特拉蒙為親本的不同雜交組合的后代對蘋果枝干輪紋病抗性存在顯著差異，其中國光×特拉蒙雜交后代平均感病級次最低，以富士為父本的雜交后代感病級次最高。因此，可選擇抗病親本來提高雜交后代的抗病性。自然發(fā)病狀況能直觀反映蘋果品種的抗病性，但輪紋病的發(fā)生和流行與氣候、樹勢、品種和栽培管理密切相關(guān)[16，17]。蘋果枝干輪紋病隨著樹齡增加病情逐漸加重[18]。

發(fā)病率和病瘤大小等均為植物抗病性評價的重要指標[19，20]。蘋果枝干輪紋病菌最直接的侵入途徑是皮孔，因此調(diào)查皮孔發(fā)病率最能直觀反映不同品種的抗病性，而發(fā)病率只能反映其抗侵入能力，病瘤直徑反映其抗擴展能力，二者相結(jié)合更能表示植物材料抗病性。

雞冠是目前調(diào)查的所有品種中唯一的免疫品種[20]，其皮孔雖然補充組織和栓內(nèi)層細胞層數(shù)少，但是木栓層完全木栓化，形成完整的封閉層，病原菌難以侵染，抗病性強。95-76補充組織和皮層細胞層厚，排列緊密也起到抗侵染作用。95-41皮孔開口，沒有木栓化的封閉層，輪紋病原菌容易從皮孔侵入，其發(fā)病率為91.39%，但是其皮層細胞排列較緊密，可限制菌絲擴展，因此其病瘤較小，直徑為1.1 mm。富士皮孔開口，沒有木栓化的封閉層封閉，加之補充組織和皮層細胞層數(shù)少，排列疏松，難以抵擋病原菌侵染，因此發(fā)病率高且病瘤直徑大。

宋宇琴等[21]研究表明，核桃1年生枝條韌皮部總酚含量在不同抗性品種間均存在極顯著差異。蘋果果實總酚含量在3個生育期都與果實輪紋病發(fā)病呈顯著負相關(guān)[22]。本試驗結(jié)果表明，雞冠和嘎拉枝皮中總酚含量明顯高于易感材料富士、95-42和95-41，但與國光差異不明顯?？共∑废?5-76總酚含量較低，顯著低于95-42和富士，與95-41差異不顯著。酚類化合物可能在一些品種中起主要的抗病作用，但植物有多種抗病機制，不同品種抗病性可能以不同抗病機制體現(xiàn)。因此，在蘋果枝干輪紋病抗病性研究中，總酚含量不可作為一個評價指標。陳建中等[23]對不同蘋果品種接種輪紋病菌后，各品種果實和枝條綠原酸含量發(fā)生明顯變化，但抗病品種（系）與感病品種差異并不顯著。王偉等[24]對甘薯接薯瘟病菌后，分析表明木質(zhì)素和綠原酸的積累與甘薯品種抗病性密切相關(guān)。本研究表明，抗病品種和感病品種間綠原酸含量有顯著差異，推測綠原酸與抗病性有關(guān)。富士樹皮中表兒茶素和香豆酸都低于其他品種（系），但是易感病品系95-42和95-41的香豆酸含量高于抗病品種95-76，因此不能推測香豆酸參與抗病反應。

通過抗病性綜合評價，篩選出9個抗病材料包括雞冠、94-9-21、94-7-13、94-1-3、94-1-42、94-2-20、94-1-13、94-1-15和95-76，以期為蘋果抗輪紋病育種提供育種材料。抗病品種（系）的皮孔具有封閉層，皮層細胞層數(shù)多且排列緊密，皮層內(nèi)綠原酸含量顯著高于感病品種（系），表明皮孔結(jié)構(gòu)與蘋果輪紋病抗病性密切相關(guān);綠原酸含量也與枝干抗病性相關(guān)，但結(jié)果需要進一步驗證。

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