劉志偉，童朝陽，穆晞惠，郝蘭群，劉　冰，張金平，高　川

（防化研究院，國民核生化災害防護國家重點實驗室，北京102205）

壓阻式微懸臂梁傳感器檢測生化毒劑的響應動力學研究

劉志偉，童朝陽*，穆晞惠，郝蘭群，劉冰，張金平，高川

（防化研究院，國民核生化災害防護國家重點實驗室，北京102205）

為了探索壓阻式微懸臂梁傳感器檢測靶分子的信號響應規(guī)律，在利用壓阻式微懸臂梁傳感器生化毒劑大量實測數(shù)據(jù)的基礎上，基于配體-受體動力學和吸附動力學創(chuàng)建了兩種壓阻式微懸臂梁傳感器檢測靶分子的動力學模型，利用創(chuàng)建的動力學模型對檢測數(shù)據(jù)進行了分析。結(jié)果表明:創(chuàng)建的模型能很好地擬合抗體、適配子等不同敏感分子檢測不同種類（大分子蛋白毒素、小分子化學毒劑）、不同濃度生化毒劑的實測數(shù)據(jù)，相關(guān)系數(shù)R值均在0.948 5以上（p＜0.01）。兩種模型中，基于配體-受體特異結(jié)合動力學模型由于考慮了敏感膜與靶分子間的特異相互作用，對傳感器實際檢測數(shù)據(jù)的擬合效果更佳，相關(guān)系數(shù)R值均在0.957 1以上（p＜0.01），能更好的反映壓阻式微懸臂梁傳感器檢測靶分子的響應特點和規(guī)律；并且能求出更有意義的平衡響應電壓（ΔUe）、響應時間（t0）等參數(shù)，根據(jù)曲線擬合方程求出的ΔUe、t0均與實測值非常接近。

壓阻式微懸臂梁；生物傳感器；生化毒劑；檢測；響應動力學

EEACC:7230M；7230J；7110；7220doi:10.3969/j.issn.1004-1699.2015.09.006

壓阻式微懸臂梁是一種新型電學讀出懸臂結(jié)構(gòu)，可直接將發(fā)生在微懸臂梁上的生化反應轉(zhuǎn)化為電壓信號進行輸出，具有讀出方式簡單、易于集成，成本低，體積小等優(yōu)點，較傳統(tǒng)光學讀出及動態(tài)模式微懸臂梁更適合于不透明、混濁等復雜環(huán)境樣品的現(xiàn)場快速檢測［1-11］。但由于壓阻式微懸臂梁的加工難度較大，目前國內(nèi)外對其的應用報道還很少。利用壓阻式微懸臂梁傳感器檢測生化靶分子時，不可避免會出現(xiàn)非特異性信號等異常信號的干擾，如何去除異常信號的干擾是數(shù)據(jù)處理中急需解決的問題，迫切需要建立傳感器檢測生化靶分子的響應動力學模型，對檢測過程中的實際響應信號進行分析。目前人們常用Langmuir等溫吸附模型來研究分子在物質(zhì)表面的吸附過程，但Langmuir等溫吸附主要是基于物理吸附原理，無法區(qū)分特異性和非特異性分子吸附［12］。本研究旨在利用壓阻式微懸臂梁傳感器生化毒劑大量實測數(shù)據(jù)的基礎上，結(jié)合配體-受體動力學創(chuàng)建一種特異信號響應的基于不同敏感分子（抗體、適配子）檢測不同類型靶分子（大分子蛋白質(zhì)、小分子化合物）的動力學模型，探索壓阻式微懸臂梁傳感器檢測生化分子的信號響應特點和通用規(guī)律，提高傳感器檢測的準確性及抗干擾能力，為未來在環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生檢驗及生物反恐等應用領(lǐng)域發(fā)展適合生化毒劑現(xiàn)場快速檢測的微小型傳感器提供技術(shù)基礎和參考依據(jù)。

1　實驗部分

1.1試劑和儀器

β-銀環(huán)蛇毒素（β-BGT）、T2毒素、蓖麻毒素（ricin）、沙林（GB）、生物素化的β-BGT多抗、生物素化的T2毒素多抗、生物素化的ricin適配子（5′-Bio-TCG CAA GAC GGA CAG AAG CTG ATT GTT ATT TTT TTT TTT GTT TAT GCT GTA TGC CAT TAG GTT GGT GGA GCG ATT TGT-3′）、生物素化的GB適配子（5′-Bio-TCG CAA GAC GGA CAG AAG TTG GGA CTG CCA CTT TGT GTT TTG GTT ATA GTA CTT ATT TGC GTT GGT GGA GCG ATT TGT-3′）由本實驗室制備；活化生物素（biotin-NHS ester）、3，3，-二巰基丙酸（DDPA）、1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、親和素（avidin）、乙醇胺均購自Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA，上海國藥集團有限公司）；PBS緩沖液（pH7.4，0.01 mol/L）、雙蒸水均自制；其他所用化學品和試劑均為分析純。

壓阻式微懸臂梁檢測平臺由本室與北京大學微電子學研究院共同搭建（壓阻式微懸臂梁傳感芯片:長200 μm，寬50μm，厚約1 μm，表面鍍金）。壓阻式微懸臂梁的檢測原理是基于半導體材料的壓阻效應，在微懸臂梁上的合適區(qū)域摻雜上半導體材料，由于微懸臂梁表面生化反應的發(fā)生而使微懸臂梁彎曲時，會引起摻雜區(qū)電阻的變化，可通過惠斯通電橋?qū)㈦娮枳兓D(zhuǎn)化為電壓變化進行輸出。

1.2壓阻式微懸臂梁傳感器的構(gòu)建

將壓阻式微懸臂梁置于檢測池中，加入DDPA （5 g/L），反應1 h使其表面金膜包被上羧基；雙蒸水清洗懸臂梁及檢測池后加入EDC（5 g/L）和NHS（5 g/L），反應0.5 h，完成對懸臂梁表面的氨基活化修飾；清洗懸臂梁后自然晾干，滴加20 μL 100 mg/L的親和素，反應0.5 h；清洗后滴加20 μL 1mol/L的乙醇胺反應0.5 h以滅活金膜表面殘余的羧基；清洗后將懸臂梁置于含PBS緩沖溶液的檢測池中，加入生物素化的敏感材料至飽和，反應約2 h，清洗懸臂梁及檢測池。本研究中的生物素化敏感材料為生物素化的β-BGT抗體、生物素化的T2毒素抗體、生物素化的ricin適配子、生物素化的GB適配子。

1.3生化毒劑的檢測

將固定好敏感材料的微懸臂梁置于含0.01 M PBS緩沖溶液的檢測池中，待信號穩(wěn)定后向檢測池中加入不同濃度的生化毒劑（β-BGT、T2毒素、ricin、GB，一個芯片測量一個濃度），記錄傳感器的輸出電壓。

1.4壓阻式微懸臂梁傳感器響應動力學分析

敏感膜與靶分子的相互作用通?？捎门潴w-受體結(jié)合和物理吸附方式來加以描述，分別基于配體—受體動力學和吸附動力學的原理，創(chuàng)建了壓阻式微懸臂梁傳感器檢測生化靶分子的動力學模型，通過對實測數(shù)據(jù)的擬合分析，探索其信號響應的特點和規(guī)律。

1.4.1基于配體—受體動力學的模型創(chuàng)建

將配體（A）溶液加到有受體（B）修飾的壓阻式微懸臂梁上，發(fā)生如下反應，生成受體-配體的結(jié)合物（C）。

在配體濃度很低的情況下，配體—受體間的結(jié)合滿足假一級動力學方程［13］:

式中:kapp為表觀反應速率常數(shù)，Ct為t時刻受體-配體復合物濃度，Ce為反應達到平衡時刻的受體-配體復合物濃度。

壓阻式微懸臂梁的總電壓靈敏度可表示為［14］:

式中:l，w，和t為懸臂梁長，寬，厚尺寸，lpr為壓阻材料的長度，Vbridge為惠斯通電橋的輸入電壓，γ是壓阻材料電阻與總電阻的比率，在簡化處理的情況下，γ=1，β*是有效因子，π0是一個常數(shù)。在均勻注入壓阻材料的情況下，對于一個特定壓阻微懸臂梁來說，β*為一個常數(shù)，因此SF也為一常數(shù)，即壓阻式微懸臂梁傳感器輸出電壓變化與懸壁梁上所受的應力Ft成正比。而Ft直接取決于懸臂梁表面形成的配體-受體復合物濃度Ct，可設Ft=K1Ct（K1為常數(shù)）。設加樣時壓阻式微懸壁梁傳感器輸出電壓為U0，t時刻輸出電壓為Ut，ΔU=Ut-U0，從而可得到:

ΔU=Ut-U0=SFFt=SFK1Ct（4）

最后，配體溶液加入到傳感器檢測池以后，需要一個時間傳感器才能響應。設響應時間為t0，結(jié)合式（2）與式（4）及此假設條件可得:

即ΔU隨t變化的理論模型，以下簡稱R模型。其中ΔUe=Ue-U0（ΔUe為反應達到平衡時刻的輸出電壓與零時刻的輸出電壓之差，即平衡響應電壓）。

1.4.2基于吸附動力學的模型創(chuàng)建

關(guān)于生化分子與傳感器表面相互作用的動力學模型，常見的是Langmuir等溫吸附模型。Langmuir方程可被表示為:

式中:K為Langmuir平衡常數(shù)，c為水溶液濃度（或氣體分壓），Γ為吸附量，Γmax為當c增加時的最大吸附量。將Langmuir方程與壓阻式微懸臂梁輸出電壓變化規(guī)律結(jié)合起來可得［15］:

Vout=Voff+A（1-e-kt）（7）

Vout為壓阻式微懸臂梁的輸出電壓，Voff為壓阻式微懸臂梁的偏置電壓，A為常數(shù)，k為吸附常數(shù)。

壓阻式微懸臂梁傳感器零時刻的輸出電壓為:

Vout-0=Voff（8）

任意時刻t時壓阻式微懸臂梁傳感器的輸出電壓為:

Vout-t=Voff+A（1-e-kt）（9）

因此，任意時刻t時的響應電壓為:

ΔU=Vout-t-Vout-0=A（1-e-kt）（10）

即ΔU隨t變化的理論模型，以下簡稱L模型。

2　結(jié)果與討論

2.1壓阻式微懸臂梁免疫傳感器的響應動力學

利用上述創(chuàng)建的兩種動力學模型對壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測不同濃度大分子蛋白（abrin）、非蛋白小分子（T2毒素）的實測數(shù)據(jù)進行響應動力學分析，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1　兩種模型擬合壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測abrin結(jié)果的對比分析

圖2　兩種模型擬合壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測T2毒素結(jié)果的對比分析

從圖1、圖2可知，創(chuàng)建的兩種壓阻式微懸臂梁傳感器響應動力學模型都能較好的反映壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測不同濃度大分子蛋白（abrin）、非蛋白小分子（T2毒素）動力學過程，相關(guān)系數(shù)R＞0.957 3（p＜0.01），其中R模型擬合實測數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)高于L模型，相關(guān)系數(shù)R＞0.971 1（p＜0.01），并且由R模型可以擬合得到兩個有實際檢測意義的模型參數(shù)，平衡響應電壓（ΔUe）及響應時間（t0）。

傳感器對8 μg/L、16 μg/L、32 μg/L abrin的實際平衡響應電壓分別為2.5 μV、10.6 μV、21.0 μV，響應時間分別為110 s、80 s、76 s；對4 μg/L、20 μg/L、60 μg/L T2毒素的實際平衡響應電壓分別為4.5 μV、7.8 μV、28.0 μV，響應時間分別為250 s、70 s、12 s。R模型中平衡響應電壓、響應時間擬合值及L模型平衡響應電壓近似擬合值參見圖1、圖2中曲線擬合方程，如R模型對8 μg/L abrin實測數(shù)據(jù)擬合的平衡響應電壓、響應時間分別為3.2 μV、121.4 s，L模型對8 μg/L abrin實測數(shù)據(jù)擬合的平衡響應電壓近似值為3.8 μV。利用R模型擬合實際平衡響應電壓的相對偏差小于利用L模型近似擬合的相對偏差，在低濃度時更為明顯，如利用R對8 μg/L abrin擬合的相對偏差為28%，而利用L模型擬合的相對偏差為52%，結(jié)果見表1。總體而言，由R模型擬合求得的傳感器平衡響應電壓、響應時間與實測值均非常接近，且隨著abrin 及T2毒素濃度的增加，傳感器響應時間縮短，平衡響應電壓增大，與實際情況具有很好的一致性。

表1　壓阻式微懸臂梁免疫傳感器的響應動力學分析

2.2壓阻式微懸臂梁適配子傳感器的響應動力學

圖3　兩種模型擬合壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測ricin結(jié)果的對比分析

利用上述創(chuàng)建的兩種動力學模型對壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測不同濃度大分子蛋白（ricin）、小分子化合物（GB）的實測數(shù)據(jù)進行響應動力學分析，結(jié)果見圖3、圖4。

圖4　兩種模型擬合壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測GB結(jié)果的對比分析

從圖3、圖4可知，創(chuàng)建的兩種壓阻式微懸臂梁傳感器響應動力學模型都能較好的反映壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測不同濃度大分子蛋白（ricin）、小分子化合物（GB）動力學過程，相關(guān)系數(shù)R＞0.948 5（p＜0.01），其中R模型擬合實測數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)高于L模型，相關(guān)系數(shù)R＞0.957 1（p＜0.01），并且由R模型可以擬合得到兩個有實際檢測意義的模型參數(shù)，平衡響應電壓（ΔUe）及響應時間（t0）。

傳感器對0.04 μg/L、0.2 μg/L、2 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L ricin的實際平衡響應電壓分別為3.5 μV、7.0 μV、8.9 μV、16.5 μV、22.0 μV、42.5 μV，響應時間分別為320 s、230 s、220 s、180 s、120 s、110 s；對10 μg/L、16 μg/L、20 μg/L、32 μg/L、60μg/L GB的實際平衡響應電壓分別為4.7 μV、8.6 μV、11.5 μV、22.5 μV、40.0 μV，響應時間分別為240 s、186 s、180 s、168 s、110 s。R模型中平衡響應電壓、響應時間擬合值及L模型平衡響應電壓近似擬合值參見圖3、圖4中曲線擬合方程。利用R模型擬合實際平衡響應電壓的相對偏差小于利用L模型近似擬合的相對偏差，在低濃度時更為明顯，如利用R模型對16 μg/L GB擬合的相對偏差為27.9%，而利用L模型近似擬合的相對偏差為58.1%，結(jié)果見表2。總體而言，由R模型擬合求得的傳感器平衡響應電壓、響應時間與實測值均非常接近，且隨著ricin及GB濃度的增加，傳感器響應時間縮短，平衡響應電壓增大，與實際情況具有很好的一致性。

表2　壓阻式微懸臂梁適配子傳感器的響應動力學分析

3　結(jié)論

根據(jù)敏感膜與靶分子相互作用規(guī)律，基于配體-受體動力學和吸附動力學創(chuàng)建了兩種壓阻式微懸臂梁傳感器檢測靶分子的動力學模型，利用創(chuàng)建的動力學模型對壓阻式微懸臂梁免疫傳感器和壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測生化毒劑的實測數(shù)據(jù)進行擬合分析。結(jié)果表明，創(chuàng)建的模型能很好地擬合抗體、適配子等不同敏感分子檢測不同種類（蛋白質(zhì)、化學小分子）、不同濃度生化毒劑的實測數(shù)據(jù)，相關(guān)系數(shù)R值均在0.948 5以上（p＜0.01）。

兩種動力學模型中，基于配體-受體特異結(jié)合的動力學模型由于考慮了敏感膜與靶分子間的特異相互作用，克服了基于物理吸附原理Langmuir模型無法區(qū)分特異性吸附和非特異性吸附響應的缺陷，能更好的反映壓阻式微懸臂梁傳感器檢測生化靶分子的響應特點和規(guī)律，較基于Langmuir等溫吸附創(chuàng)建的動力學模型能更好擬合實際檢測數(shù)據(jù)，在濃度較低的情況下更為明顯，并能求出更有意義的平衡響應電壓（ΔUe）、響應時間（t0）等參數(shù)，根據(jù)曲線擬合方程求出的傳感器平衡響應電壓（ΔUe）、響應時間（t0）均與實測值非常接近。該模型未來可用于生化分子檢測的數(shù)據(jù)分析、處理及非特異性干擾信號的排除，在提高壓阻式微懸臂梁傳感器檢測的準確性及抗干擾能力上具有廣闊的應用前景。

［1］ Patil S J，Adhikari A，Baghini M S，et al.An Ultra-Sensitive Piezoresistive Polymer Nano-Composite Microcantilever Platform for Humidity and Soil Moisture Detection［J］.Sensors and Actuators B，2014（203）:165-173.

［2］ Rajavelu M，Sivakumar D，Daniel R J，et al.Perforated Diaphragms Employed Piezoresistive MEMS Pressure Sensor for Sensitivity Enhancement in Gas Flow Measurement［J］.Flow Measurement and Instrumentation，2014（35）:63-75.

［3］ Sang Shengbo，Zhao Yuan，Zhang Wendong，et al.Surface Stress-Based Biosensors［J］.Biosensors and Bioelectronics，2014（51）: 124-135.

［4］ Thuau D，Ayela C，Poulin P，et al.Highly Piezoresistive Hybrid MEMS Sensors［J］.Sensors and Actuators A，2014（209）:161-168.

［5］ Yang S M，Chang C.A Piezoresistive Bridge-Microcantilever Biosensor by CMOS Process for Surface Stress Measurement［J］.Sensors and Actuators B，2010（145）:405-410.

［6］ Pandya H J，Roy R，Chen W J，et al.Accurate Characterization of Benign and Cancerous Breast Tissues:Aspecific Patient Studies Using Piezoresistive Microcantilevers［J］.Biosensors and Bioelectronics，2015（63）:414-424.

［7］ García-Romeo D，Pellejero I，Urbiztondo M A，et al.Portable Low-Power Electronic Interface for Explosive Detection Using Microcantilevers［J］.Sensors and Actuators B，2014（200）:31-38.

［8］ Sang S B，Zhao Y，Zhang W D，et al.Surface Stress-Based Biosen-sors［J］.Biosensors and Bioelectronics，2014（51）:124-135.

［9］ Zhang Q，Ruan W Z，Wang H，et al.A Self-Bended Piezoresistive Microcantilever Flow Sensor for Low Flow Rate Measurement［J］. Sensors and Actuators A，2010（158）:273-279.

［10］李建華，徐立新，陳和峰，等.基于MEMS技術(shù)的新型太赫茲混頻器設計與制作［J］.傳感技術(shù)學報，2015，28（1）:9-12.

［11］俞鋒，李昕欣，于海濤.平面內(nèi)諧振式微懸臂梁生化傳感器的設計與制造［J］.傳感技術(shù)學報，2012，25（7）:869-875.

［12］黃淵，劉紅，張青川.利用微懸臂梁研究聚N-異丙基丙烯酰胺在金表面的自組裝［J］.物理學報，2009，58（9）:6122-6127.

［13］周廷沖.受體生化藥理學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1985: 104-108.

［14］Doll J C，Park S J，Pruitt B L.Design Optimization of Piezoresistive Cantilevers for Force Sensing in Air and Water［J］.Journal of Applied Physics，2009，106:064310-0-064310-12.

［15］Yang S M，Chang C，Yin T I，et al.DNA Hybridization Measurement by Self-Sensing Piezoresistive Microcantilevers in CMOS Biosensor［J］.Sensors and Actuators B，2008，130:674-681.

劉志偉（1989-），男，湖南婁底人，研究實習員。主要研究方向為生物檢測技術(shù)，liuzhw07@lzu.edu.cn。

Study on Response Kinetics of Piezoresistive Microcantilever Sensor for CBW Agents Detection

LIU Zhiwei，TONG Zhaoyang*，MU Xihui，HAO Lanqun，LIU Bing，ZHANG Jinping，GAO Chuan
（State Key Laboratory of NBC Protection for Civilian，Research Institute of Chemical Defense，Beijing 102205，China）

A research about the response kinetics for piezoresistive microcantilever sensor based on mass data of CBW agents detection and molecule kinetic model（receptor-ligand kinetics or adsorption kinetics）has been made，receiving two response kinetic models of piezoresistive microcantilever sensor under different molecule kinetic model.The built models were used to fit the measured data of CBW agents.Results showed that both these two models could well fit the measured data of CBW agents under different types（macromoleule protein toxin and micromolecule chemical agents）and different concentrations，modifying with different sensitive molecules（antibodies and aptamers）.The correlation coefficient R was greater than or equal to 0.948 5（p＜0.01）.In these two models，the model based on specific binding of ligand-receptor could fit the measured data better since it considered the specific interaction between sensitive molecules and target molecules.The correlation coefficient R was greater than or equal to 0.957 1（p＜0.01），which could better reflect the response kinetics of piezoresistive microcantilever sensor.And it could give some more meaningful parameters，such as response voltage（ΔUe）and response time（t0）.Response voltage（ΔUe）and response time（t0）obtained from the fitting equation on different target molecules fitted well with the measured values.

piezoresistive microcantilever；biosensor；CBW agent；detection；response kinetic

TP301

A

1004-1699（2015）09-1297-06

2015-02-13修改日期:2015-07-20