楊雪薇,楊 爽,董冰雪,郭魯強(qiáng),劉 暉,滕樂(lè)生

(1.吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,長(zhǎng)春 130012;2.吉林大學(xué)第四醫(yī)院 藥學(xué)部,長(zhǎng)春 130011)

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用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法優(yōu)化硝苯地平脂質(zhì)體處方

楊雪薇1,楊 爽1,董冰雪1,郭魯強(qiáng)1,劉 暉2,滕樂(lè)生1

(1.吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,長(zhǎng)春 130012;2.吉林大學(xué)第四醫(yī)院 藥學(xué)部,長(zhǎng)春 130011)

采用乙醚注入法制備硝苯地平脂質(zhì)體,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法考察磷脂量、脂藥比和膽固醇磷脂比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響.結(jié)果表明:多元二次回歸模型最優(yōu)處方制備的硝苯地平脂質(zhì)體平均包封率為86.54%;人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)合遺傳算法最優(yōu)處方制備的硝苯地平脂質(zhì)體平均包封率為97.25%;與二次回歸模型相比,人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型更適于優(yōu)化硝苯地平脂質(zhì)體的制備.優(yōu)化后得到最佳制備處方為：磷脂量612.4 mg,脂藥比為60.02,磷脂膽固醇比為6.401.

硝苯地平；脂質(zhì)體；乙醚注入法；Box-Behnken；人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

硝苯地平(nifedipine)是鈣離子拮抗劑類藥物的典型代表,為黃色結(jié)晶粉末或針狀晶體,在臨床上用于心絞痛、高血壓及心衰的治療[1-2].但硝苯地平存在水中溶解度小、制劑生物利用度低、對(duì)光敏感、遇光分解產(chǎn)物有毒和穩(wěn)定性差等缺點(diǎn).研究表明,脂質(zhì)體制劑可顯著提高藥物的治療指數(shù),減少給藥次數(shù),從而降低藥物的不良反應(yīng),是一種高效低毒的新型給藥系統(tǒng)[3-4].由于脂質(zhì)體處方的設(shè)計(jì)較復(fù)雜,因此采用單因素設(shè)計(jì)等常規(guī)方法不易得到最優(yōu)結(jié)果.人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)是基于生物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的非線性計(jì)算模型,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相互關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)的數(shù)學(xué)模型模擬人腦學(xué)習(xí)過(guò)程[5].在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立后,其內(nèi)存空間被遺傳算法(GA)充分利用,GA是非線性的最優(yōu)化形式[6].本文采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法優(yōu)化硝苯地平脂質(zhì)體的處方,應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),利用多元二次回歸模型[7-8]和ANN模型結(jié)合GA對(duì)硝苯地平脂質(zhì)體處方進(jìn)行篩選.

1 材料與方法

1.1儀器與試藥

LC-10AVP型高壓液相色譜儀(日本島津公司)；BS224S型電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；PhD D3-L型高壓均質(zhì)機(jī)(美國(guó)Phdtech公司)；5810R型冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司).硝苯地平(陜西惠誠(chéng)生物科技有限公司)；硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；蛋黃卵磷脂(廣州漢方有限公司)；膽固醇(上海惠世生化試劑有限公司)；甲醇和乙腈為色譜純;無(wú)水乙醚等其他試劑為分析純.

1.2方法

1.2.1 乙醚注入法制備硝苯地平脂質(zhì)體 取適量卵磷脂、膽固醇和硝苯地平,加入一定量乙醚攪拌,溶解.將乙醚溶液用注射器快速注入已恒溫至30 ℃的45 mL去離子水中,30 ℃攪拌2 h,使乙醚揮發(fā)盡,制成脂質(zhì)體.用高壓均質(zhì)法進(jìn)行整粒,均質(zhì)壓力為55 MPa,共均質(zhì)8次[9].

1.2.2 硝苯地平質(zhì)量濃度測(cè)定 HPLC條件：色譜柱為460 mm×150 mm的C18柱,檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃.流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=1,進(jìn)樣量20 μL[10].先將10 mg硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)品配置成200 μg/mL的硝苯地平乙醇母液,再用逐級(jí)稀釋的方法配置各溶液,用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后,依次進(jìn)樣.

1.2.3 包封率測(cè)定 取制備的硝苯地平脂質(zhì)體100 μL,甲醇破乳,過(guò)0.22 μm濾膜后注入高效液相色譜儀測(cè)定.取5 mL硝苯地平脂質(zhì)體于8 000 r/min離心30 min后,取上清液100 μL,甲醇破乳,過(guò)0.22 μm濾膜后注入高效液相色譜儀測(cè)定,計(jì)算包封率.

1.2.4 單因素試驗(yàn)優(yōu)化脂質(zhì)體制備處方

1)磷脂量的考察：稱取硝苯地平10 mg,膽固醇100 mg,分別稱取蛋黃卵磷脂200,300,400,500,600,700 mg,按1.2.1方法進(jìn)行操作,得到脂質(zhì)體.

2)脂藥比的考察：稱取蛋黃卵磷脂600 mg,膽固醇100 mg,分別稱取m(蛋黃卵磷脂)∶m(原料藥)=20,40,60,80,100,120,按1.2.1方法進(jìn)行操作,得到脂質(zhì)體.

3)膽固醇磷脂比的考察：稱取蛋黃卵磷脂600 mg,硝苯地平7.5 mg,膽固醇適量,分別使m(膽固醇)∶m(蛋黃卵磷脂)=0,1∶24,1∶12,1∶8,1∶6,1∶4,按1.2.1方法操作,得到脂質(zhì)體.

1.2.5 Box-Behnken效應(yīng)面優(yōu)化處方設(shè)計(jì) 在單因素基礎(chǔ)上,進(jìn)行3因素3水平的中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),按表1的因素水平表進(jìn)行15組實(shí)驗(yàn),測(cè)定脂質(zhì)體包封率,以包封率為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用多元二次回歸模型分析.

表1 Box-Behnken因素水平表Table 1 Variables in Box-Behnken design

1.2.6 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)化處方 從Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)中隨機(jī)抽取一組數(shù)據(jù)作為預(yù)測(cè)集和測(cè)試集,其他數(shù)據(jù)作為校正集.3層反饋給人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型,由于一些隱藏節(jié)點(diǎn)對(duì)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型影響較大,因此采用接近標(biāo)準(zhǔn)程度(Da)選擇合適的隱藏節(jié)點(diǎn)：

(1)

其中:MSEc和MSEt為校準(zhǔn)設(shè)置和驗(yàn)證設(shè)置的均方誤差(MSE);nc和nt為校準(zhǔn)設(shè)置和驗(yàn)證設(shè)置的數(shù)量;n為校準(zhǔn)設(shè)置和驗(yàn)證設(shè)置的總數(shù);c為調(diào)整較好Da的一個(gè)連續(xù)數(shù)字(本文c=1 000).所得結(jié)果用MATLAB7.6.0.324(R2008a,美國(guó)MathWorks公司)軟件分析.

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型確立后,用GA在測(cè)試區(qū)域內(nèi)搜尋最優(yōu)值.GA參數(shù)為：群體類型為雙重向量,群體容量為20,初始群體隨機(jī)給出,作為隨機(jī)統(tǒng)一的選擇功能,精確算法為2,交叉率為0.8,交叉作用是離散的,遷移率為0.2,罰因子為100,用GA得到的世代數(shù)目為100.擬合度定義為

(2)

其中NTANN model為通過(guò)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型計(jì)算得到的NT值.

1.2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 為檢驗(yàn)多元二次回歸模型和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)處方的準(zhǔn)確性與可行性,分別用各自得到的最佳處方配比制備硝苯地平脂質(zhì)體,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn).

2 結(jié)果與討論

2.1硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以色譜峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=77 476.023 98x-21 820.591 56,R2=0.999 73,表明硝苯地平在5～40 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

因素X1,X2,X3對(duì)硝苯地平脂質(zhì)體包封率的影響如圖1所示.由圖1可見(jiàn),X1,X2,X3的最佳值分別為600 mg,80,1∶6.因此確定以最佳條件為中心組合實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化.

圖1 X1(A),X2(B)和X3(C)對(duì)包封率的影響Fig.1 Effects of X1(A),X2(B)and X3(C)on the encapsulation efficiency of liposome

2.3Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化處方設(shè)計(jì)結(jié)果

中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2,多元二次回歸分析結(jié)果列于表3.

表2 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Matrix of Box-Behnken design and the corresponding experimental results

擬合得到回歸方程為

(3)

該模型P=0.003 021,相關(guān)系數(shù)R2=96.85%,表明96.85%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均符合該模型擬合,即該方程的擬合充分,回歸方程高度顯著,模型準(zhǔn)確可行.

表3 多元二次回歸分析結(jié)果Table 3 Statistical results of multivariate quadratic regression analysis

回歸分析結(jié)果的響應(yīng)曲面如圖2所示.由圖2可見(jiàn),在檢測(cè)范圍內(nèi),3個(gè)響應(yīng)曲面均為開(kāi)口向下的凸形曲面,表明響應(yīng)值(提取率)存在極高值,其等高線中心均位于-1～1,表明提取的最優(yōu)條件存在于所設(shè)計(jì)的因素水平范圍內(nèi).圖2(C)中的等高線呈橢圓形,且坐標(biāo)軸與橢圓形軸線間存在較大的夾角,表明X1和X3間存在顯著的交互作用.計(jì)算得到最優(yōu)提取條件的編碼值為：X1=-0.038 66,X2=-0.600 75,X3=-0.052 58,代入變換公式可得Z1=596.134 mg,Z2=67.985,Z3=5.947,即最佳處方為：磷脂質(zhì)量596.134 mg,m(脂)∶m(藥)=67.985,m(膽固醇)∶m(磷脂)=1∶5.947,由回歸方程可得包封率的預(yù)測(cè)值為93.065%.

圖2 響應(yīng)面和等高線圖Fig.2 Responsive surfaces and contours

2.4人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)果

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)果如圖3所示.由圖3可見(jiàn),第11個(gè)節(jié)點(diǎn)Da值最大.當(dāng)隱藏的節(jié)點(diǎn)數(shù)設(shè)定為11時(shí),優(yōu)化后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的決定系數(shù)R2=0.951 6,表明人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型可靠.世代數(shù)對(duì)擬合度的影響如圖4所示.由圖4可見(jiàn):當(dāng)世代數(shù)為31時(shí),擬合度最低；世代數(shù)繼續(xù)增長(zhǎng)時(shí),擬合度基本保持不變.通過(guò)GA獲得優(yōu)化后培養(yǎng)條件的編碼值為：U1=0.124,U2=-0.999,U3=0.401; 對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)值為：W1=612.4 mg,W2=60.02,W3=6.401.在優(yōu)化后處方條件下的預(yù)期包封率為98.457 8%.

圖3 隱藏層節(jié)點(diǎn)數(shù)對(duì)Da的影響Fig.3 Effect of the number of hidden nodes on Da

圖4 世代數(shù)對(duì)擬合度的影響Fig.4 Effect of the number of generations on fitness

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

多元二次回歸模型最優(yōu)處方制備的硝苯地平脂質(zhì)體平均包封率為86.54%,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為4.62%;人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型最優(yōu)處方制備的硝苯地平脂質(zhì)體平均包封率為97.25%,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.86%.兩組驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明,人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型更適于制備硝苯地平脂質(zhì)體.

綜上所述,本文采用乙醚注入法制備硝苯地平脂質(zhì)體,高壓均質(zhì)法進(jìn)行整粒,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),通過(guò)多元二次回歸模型和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)合GA算法,考察了m(磷脂)、m(脂)∶m(藥)、m(膽固醇)∶m(磷脂)對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響.結(jié)果表明,與多元二次回歸模型相比,人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型更適于制備硝苯地平脂質(zhì)體,優(yōu)化后最優(yōu)處方為m(磷脂)=612.4 mg,m(脂)∶m(藥)=60.02,m(膽固醇)∶m(磷脂)=1∶6.401,其包封率為97.25%.

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(責(zé)任編輯：?jiǎn)?凝)

OptimizethePreparationFormulationofNifedipineLiposomebyStatisticalMethods

YANG Xuewei1,YANG Shuang1,DONG Bingxue1,GUO Luqiang1,LIU Hui2,TENG Lesheng1

(1.CollegeofLifeScience,JilinUniversity,Changchun130012,China；2.DepartmentofPharmacy,TheFourthHospitalofJilinUniversity,Changchun130011,China)

The nifedipine liposome was prepared from an appropriate amount of lecithine,cholesterol and nifedipine by the ether injection method.On the basis of single factor experiment,we used statistical methods to investigate the effects of phospholipid amount,lipid drug ratio,cholesterol phospholipid ratio on the encapsulation efficiency of liposome.The results show that the encapsulation rate of the liposome prepared based on multivariate quadratic regression model was 86.54%,and the encapsulation rate of the liposome prepared based on artificial neural network model was 97.25%.Compared with the quadratic regression model,artificial neural network model combined with genetic algorithm is more suitable for optimizing the preparation technique of nifedipine liposome.After optimizing,the best preparation formulation is 612.4 mg of phospholipid with a lipid drug ratio of 60.02 and a cholesterol phospholipid ratio of 6.401.

nifedipine;liposome;ether injection method;Box-Behnken;artificial neural network

10.13413/j.cnki.jdxblxb.2015.03.41

2014-07-14.

楊雪薇(1990—),女,漢族,碩士研究生,從事生物制藥技術(shù)的研究,E-mail:yangxw1309@163.com.通信作者：滕樂(lè)生(1983—),男,漢族,博士,副教授,從事生物制藥技術(shù)的研究,E-mail:tenglesheng@jlu.edu.cn.

R944

：A

：1671-5489(2015)03-0572-05