謝 偉 ，程 洋 ，張 勇 ，文水英 ，張德勇 ，馬永梅

（1.四川省樂山市沙灣區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 樂山 614900；2.四川省樂山市沙灣區(qū)譚壩鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，四川 樂山 614903；3.四川省樂山市沙灣區(qū)嘉農(nóng)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，四川 樂山 614902）

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）屬于冠狀病毒科，是引起仔豬腸道疾病的重要病原之一，以急性腹瀉、嘔吐、脫水為臨床癥狀，可致2周齡內(nèi)的仔豬100%死亡[1]。目前該病無特效治療藥物，接種有效的豬傳染性胃腸炎疫苗是預(yù)防本病的主要手段。

1 TGEV結(jié)構(gòu)蛋白

TGEV為有囊膜病毒，基因組為單股正鏈具有感染性的RNA，全長(zhǎng)約28.5kb，分子量為6×103ku[2]。TGEV全基因組分為7個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)包含1個(gè)或多個(gè)開放閱讀框（ORF），整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)順序?yàn)?′1a-1b-S-3a-3b-sM-M-N-3′，其中基因 S、sM、M、N 編碼TGEV的四種結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突蛋白（S）、核蛋白（N）、膜結(jié)合蛋白（M）和小膜蛋白（sM），這4種結(jié)構(gòu)蛋白及其在病毒粒子中的功能各有特點(diǎn)。

1.1 S蛋白 纖突蛋白（S）為糖蛋白，具有花瓣?duì)钅夷ね黄?，突出于病毒粒子表面。編碼S蛋白的S基因全長(zhǎng)約4350bp，最初合成的S蛋白前體由1447或1449個(gè)氨基酸殘基組成，經(jīng)切除信號(hào)肽和終末糖基化而成熟，分子量約195～220ku，是TGEV結(jié)構(gòu)蛋白中最大的蛋白。S蛋白攜帶的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在TGEV免疫保護(hù)方面發(fā)揮主導(dǎo)作用[3]。

1.2 N蛋白 N蛋白是一種磷酸化的酸性蛋白，并以螺旋式結(jié)構(gòu)圍繞RNA存在于病毒粒子內(nèi)部，是病毒核衣殼形成螺旋形結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。編碼N蛋白的N基因長(zhǎng)約1700bp，分子質(zhì)量約為45kD，編碼382個(gè)氨基酸，氨基酸殘基纏繞在一起，纏繞程度與絲氨酸的專一磷酸化有關(guān)[4]。N蛋白具有A、B、C三個(gè)高度保守的抗原區(qū)域，在誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答中起著重要作用[5]。

1.3 M蛋白 M蛋白是一種膜蛋白，在冠狀病毒中含量最多，是病毒粒子裝配的必需成分。編碼M蛋白的M基因全長(zhǎng)約2600bp，編碼262個(gè)氨基酸殘基的M蛋白前體，切掉其N末端17個(gè)氨基酸殘基信號(hào)肽而成熟，分子質(zhì)量約為29～31ku，連接1條富含甘露糖天冬酰胺的側(cè)鏈。M蛋白的6～22氨基酸殘基區(qū)有一干擾素基因決定簇，可以幫助TGEV誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，TGEV感染的仔豬血液和腸道中可檢測(cè)出高水平的IFN-α[6]。用M蛋白制備的特異性單克隆抗體能有效地阻斷IFN-α干擾素的合成，而S、N蛋白的特異性單克隆抗體無此作用，提示在宿主抵抗病毒感染過程中M蛋白發(fā)揮了重要作用。

1.4 sM蛋白 sM結(jié)構(gòu)蛋白是一種較小的膜結(jié)合蛋白，抗原位點(diǎn)位于C末端。編碼sM蛋白的基因全長(zhǎng)約249 bp，編碼82個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約78 ku，多肽掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)64-AYKNF-68殘基是誘導(dǎo)產(chǎn)生抗sM單克隆抗體的核心序列。Baudou等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TGEV M蛋白和sM蛋白共表達(dá)是病毒樣顆粒組裝和釋放的必要條件，而且M蛋白與sM蛋白形成的VLPs能夠誘導(dǎo)IFN-α產(chǎn)生，可抵御TGEV的感染。

2 疫苗研究

TGEV疫苗大致經(jīng)歷了4個(gè)階段，即人工感染強(qiáng)毒、滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗。

2.1 人工感染強(qiáng)毒 人工感染強(qiáng)毒是將發(fā)病豬的內(nèi)臟或排泄物（含有強(qiáng)毒）摻入飼料飼喂，感染全場(chǎng)成年豬，尤其是妊娠后期母豬，使之產(chǎn)生免疫力，通過初乳保護(hù)仔豬。該方法雖然使仔豬獲得了一定的保護(hù)，但易造成場(chǎng)地等環(huán)境污染，且母豬抵抗力降低后易繼發(fā)感染其他疫病，導(dǎo)致強(qiáng)毒持續(xù)存在，不利于對(duì)該病原的消滅和控制，該方法現(xiàn)已被疫苗取代。

2.2 滅活疫苗 TGEV滅活疫苗分為組織滅活苗和細(xì)胞滅活苗。曹軍平等[8]采集急性發(fā)病且具有典型癥狀的病豬空腸（包括腸內(nèi)容物）及腸系膜淋巴結(jié)，通過凍融、滅活、乳化制成組織滅活苗，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室和野外試驗(yàn)證實(shí)該苗安全可靠、保護(hù)率較高。賈華強(qiáng)[9]利用分離的TB株制成滅活細(xì)胞苗在4個(gè)流行TGE的豬場(chǎng)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示免疫母豬所產(chǎn)仔豬在斷乳時(shí)的死亡率平均是8.5%，表明TGE細(xì)胞滅活苗具有較好的保護(hù)率。滅活疫苗雖然具有一定的保護(hù)率，也可以解決場(chǎng)地污染問題，但其只能通過注射免疫，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答較慢，不能刺激母豬產(chǎn)生有效的乳汁免疫，且制苗成本也比較高昂。

2.3 弱毒疫苗 TGEV弱毒疫苗毒株主要有美國(guó)的TGE-Vac株、匈牙利的CKP株、日本的TO-163株以及我國(guó)的華泰株。華泰株是在原代胎豬腎細(xì)胞上經(jīng)165次傳代致弱，并經(jīng)過5次克隆純化篩選而得。弱毒苗不宜在腸黏膜上皮細(xì)胞上吸附增殖，對(duì)腸黏膜的刺激較弱，因此乳汁中主要是IgG抗體，分泌型IgA較少，這是長(zhǎng)期認(rèn)為弱毒疫苗免疫效果不理想的主要原因。弱毒疫苗的免疫原性雖然優(yōu)于滅活疫苗，但存在潛伏感染、排毒散毒、毒力返祖等缺陷。

2.4 基因工程疫苗 傳統(tǒng)疫苗雖然在預(yù)防TGE上有一定的效果，但在某種程度上存在不可避免的缺陷。隨著對(duì)TGEV分子生物學(xué)研究的深入，TGEV基因工程疫苗的研究取得了較快發(fā)展。

2.4.1 亞單位疫苗 亞單位疫苗可分為生物合成亞單位疫苗和重組抗原表位亞單位疫苗。生物合成亞單位疫苗是把保護(hù)性抗原基因?qū)爰?xì)胞或受體菌，將其高效表達(dá)產(chǎn)物加以適合的佐劑乳化而制成。秦志華等[10]將S基因上A、B、C、D四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-S，將純化的蛋白免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的體液免疫。用抗原表位氨基酸序列制備的疫苗稱為重組抗原表位亞單位疫苗。亞單位疫苗安全性高、副作用小，但免疫原性沒有全病毒的好，產(chǎn)生的中和抗體水平低。因此，開發(fā)出增強(qiáng)亞單位疫苗免疫原性的佐劑已成為研究熱點(diǎn)。

2.4.2 核酸疫苗 又稱基因疫苗，是將編碼某種抗原蛋白的外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上并導(dǎo)入動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)，通過宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答。任曉峰等[11]在國(guó)內(nèi)外首次構(gòu)建了含有TGEV S基因的主要抗原位點(diǎn)（A、C、D）的SaPCI和含有TGEV完整S基因的SPCI兩種核酸疫苗，將這兩種重組核酸疫苗免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)兩者都具有能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性反應(yīng)的免疫能力，但前者的免疫效果優(yōu)于后者。宋振輝等[12]將TGEV的M和N結(jié)構(gòu)蛋白基因分別克隆到FastBacTMDual載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9，獲得重組桿狀病毒rBac-M和rBac-N，通過口服免疫小鼠，結(jié)果顯示該重組桿狀病毒可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生黏膜免疫和體液免疫應(yīng)答。核酸疫苗具有易于制備、可塑性大、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，并可以同時(shí)構(gòu)建編碼不同蛋白的重組質(zhì)粒同時(shí)預(yù)防多種疫病。但核酸疫苗也有這樣一些問題，如外源目的基因選擇問題，載體和載體啟動(dòng)子對(duì)外源基因表達(dá)有影響等。

2.4.3 轉(zhuǎn)基因植物疫苗 隨著植物高效基因載體系統(tǒng)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)動(dòng)物基因工程疫苗用于防控動(dòng)物疫病已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。Gomez等[13]將TGEV的S基因克隆到花椰菜花葉病毒（CaMV35S）啟動(dòng)子下游并轉(zhuǎn)染到擬南芥的種子中，成功構(gòu)建了TGEV轉(zhuǎn)基因植物疫苗，用該植物飼喂生豬可產(chǎn)生中和抗體，具有免疫保護(hù)作用。Gomez等[14]將TGEV的S蛋白的N端結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)入到馬鈴薯中制成轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，用其飼喂小鼠可產(chǎn)生抗S蛋白的特異性血清抗體。目前，TGEV的S基因已被轉(zhuǎn)入馬鈴薯、煙草、紅豆花葉、擬南芥、玉米等植物中，并進(jìn)行了相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，部分已檢出相應(yīng)抗體，表明TGEV轉(zhuǎn)基因植物疫苗有廣闊的發(fā)展前景。

3 結(jié)語

近年來，隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)TGEV基因組結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)蛋白和基因工程苗等方面的研究已取得了較大的進(jìn)展，但對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能、抗TGEV感染的保護(hù)性免疫機(jī)制、毒株間的變異對(duì)致病性的影響等還有待于深入研究。此外，由于疫苗生產(chǎn)技術(shù)等因素的影響，傳統(tǒng)疫苗在市場(chǎng)上仍占有較大的比例，改進(jìn)工藝、研究免疫原性好的菌（毒）株，尤其是基因工程疫苗，將是今后疫苗研究的一個(gè)重要方向。

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