李芳蓉，劉鳳霞，劉淑梅，陳 軍，張尚智

（甘肅中醫(yī)學院定西校區(qū)，甘肅 定西743000）

甘肅省定西市隴西縣是“中國黃芪之鄉(xiāng)”。梁代醫(yī)藥學家陶弘景《本草經(jīng)集注》云：“黃芪第一出隴西，色黃白，味甜美，今亦難得。”可見，黃芪為隴西地道珍貴藥材，并以根條粗大、質(zhì)堅而綿、粉性足、藥用成份含量高而成為芪中精品，具有“補氣升陽、益固表，利水消腫，托瘡生肌”之功效，因質(zhì)量穩(wěn)定，療效確切，用途不斷拓展。黃芪是典型根類中草藥，未處理前根部可能帶有大量泥土、病原生物及蟲卵等，貯藏、運銷和深加工前需耗費大量人力和水進行洗滌、晾曬和硫磺熏蒸防蛀、防腐等，且凈洗效果欠佳。采用超聲波清洗則可能降低勞動強度、節(jié)水、徹底清洗泥土、抑制病原微生物與蟲卵、防止藥效成分散失等。但超聲波清洗后有效成分散失與否、散失量高低需實驗驗證。超聲波技術(shù)在藥材有效成分提取中已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但在清洗中的定性和定量研究較少。本文針對定西市三大主栽根類中草藥之一黃芪，探討確定普通水洗和不同超聲頻率和強度的超聲波清洗黃芪后，其有效成分散失與否及散失量的定性、定量分析檢測項目和方法手段。

1 分析檢測項目的確定

黃芪又名綿芪、綿黃芪，是一味重要的傳統(tǒng)大宗藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，是當前中醫(yī)臨床處方和中成藥中用量最大的中藥之一，藥界素有“十藥八芪”之稱，也是出口的大宗品種。《中國藥典》2010 版一部規(guī)定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hisao）或膜莢黃芪（Astraga-lus membranaceus（Fisch.）Bge.）的干燥根及根莖，黃芪味甘，性微溫，歸脾、肺經(jīng)。具有補氣升陽、益衛(wèi)固表、生津養(yǎng)血，行滯通痹、托毒生肌和利水消腫等功效；臨床用于脾肺氣虛、食少便溏、中氣下陷、久瀉脫肛、便血崩漏、表虛自汗、癰疽難潰、氣虛血滯、浮腫尿少、半身不遂和痹痛麻木、慢性腎炎、蛋白尿及糖尿病等。藥理作用為提高免疫功能、增強抗氧化、抗輻射、抗骨質(zhì)疏松、抗突變、抗癌作用，保護心腦血管、肝、腎和肺，保護腦細胞、提高記憶力，舒張血管平滑肌，抗心律失常、清除自由基、抗細胞凋亡、抗衰老、抗菌抑病毒作用，降血脂、降血糖、雙向調(diào)節(jié)血壓、減少糖尿病并發(fā)癥等。臨床上廣泛用于治療循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌和血液系統(tǒng)疾病，且未見明顯肝腎毒性。

黃芪主要含黃芪多糖、黃芪皂苷、黃酮類、氨基酸和微量元素等。多糖類以葡聚糖和雜多糖為主。黃酮類有黃酮、異黃酮、異黃烷和紫檀烷四大類。皂苷類有黃芪皂苷及其大豆皂苷；氨基酸主要有氨基丁酸、天冬酰胺、天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等25種；微量元素主要有Sc、Se、Cr、Mn、Co、Cu、Zn等。還含有生物堿、甾醇類物質(zhì)、葉酸、亞麻酸、亞油酸、尼克酸、核黃素、維生素P、淀粉E 等。長期研究認為，黃芪的有效成分群主要為多糖、黃芪皂苷和黃酮，其中主要有效成分為黃芪多糖、黃芪皂苷Ⅳ、黃芪黃酮等。黃芪皂苷Ⅳ、毛蕊異黃酮及芒柄花素的含量可作為指標來評價黃芪藥材的質(zhì)量優(yōu)劣。《中國藥典》2010版將黃芪甲苷和毛蕊異黃酮苷作為指標性成分控制黃芪藥材及制劑的質(zhì)量。

1.1 黃芪皂苷Ⅳ

黃芪皂苷Ⅳ（Astragaloside Ⅳ，AST），又稱黃芪甲苷或黃芪皂苷甲，分子式C41H68O14，分子量784.97，白色結(jié)晶或棕黃色粉末?，F(xiàn)代藥物化學研究確定，黃芪總苷（Astragaloside）是黃芪中具有心腦血管藥理作用的標準藥效組分。黃芪皂苷Ⅳ是一種羊毛酯醇形的四環(huán)三萜皂苷，為10多種黃芪皂苷的主要有效成分，生物活性最好，是評價黃芪及其制劑質(zhì)量的定性定量指標。且許多中成藥也以黃芪甲苷作為指標成分。黃芪皂苷Ⅳ具有護心、強心，保護大腦和內(nèi)皮屏障功能損傷，抗胃潰瘍，抑制膠原增生，改善血液流變學，抗衰老，調(diào)節(jié)免疫功能，保肝護肝、抗菌抗炎、降壓、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、利尿、促進胰島素分泌等作用。其抑制缺氧／復氧所致心肌細胞損傷的機制或以上調(diào)PKA-Cα 基因表達，提高受磷蛋白（PLN）16位絲氨酸磷酸化水平，解除PLN 對SER-CA2a的抑制，從而增強SERCA2a的功能。

1.2 黃芪多糖

黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是黃芪的主要活性成分和發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵物質(zhì)，主要包括葡聚糖和雜多糖，其中葡聚糖有水溶性和水不溶性兩種，分別是α-（1→4）（1→6）葡聚糖和α-（1→4）葡聚糖。APS多為水溶性，水溶液能使碘液變藍，主要含葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖，少量含有糖醛酸由半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸組成；而有些僅由葡萄糖和阿拉伯糖組成。熔點＞200℃。各組分均有較大比旋光值，以D-型單糖和α-糖苷鍵為主，紫外圖譜顯示多糖的特征吸收峰。APS經(jīng)水解后得到單糖，已鑒定的有L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、D-半乳糖，D-葡萄糖，D-甘露糖九種。APS對機體免疫系統(tǒng)具有較廣泛調(diào)節(jié)作用，從而全面提高機體的免疫防御及免疫監(jiān)視功能，增強機體抵抗外界不良因素的侵害。APS一方面可直接作用于免疫細胞，另一方面可通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)間的相互調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用?？勺鳛槊庖叽龠M劑或調(diào)節(jié)劑，可清除氧自由基，降低脂質(zhì)過氧化，抵抗自由基損傷，具有強心降壓、降血糖、抑菌、抗病毒、抗炎、抗癌、抗衰老、抗輻射、抗應(yīng)激、抗氧化等藥理功效。APS 還具有血脂調(diào)節(jié)作用，能有效地降低正常人血液中總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇水平，保護肝腎肺及血管的作用。注射用APS是目前較理想的安全有效腫瘤用藥。

1.3 黃芪黃酮

黃芪黃酮（Flavonoids Astragalus，F(xiàn)A）是黃芪的活性有效成分之一，能夠保護血管內(nèi)皮細胞、抗氧化和抗動脈硬化，黃酮類成分是其保護心血管作用的主要有效成分之一，可作為鑒別黃芪藥材質(zhì)量的指標之一。至今大概分離得到將近40種黃酮類化合物，黃酮、異黃酮、異黃烷和紫檀烷共四大類。槲皮素、山奈黃素、異鼠李素、鼠李異檸檬素、羥基異黃酮、異黃烷、蘆丁、芒柄花素、毛蕊異黃酮及其糖苷以及芒柄花素和芒柄花苷等。

藥理學研究表明，黃芪黃酮具有調(diào)節(jié)免疫、抗心肌缺血、保肝、抗炎、抗突變、清除自由基等多種藥理作用。藥理學研究表明異黃酮是黃芪的有效成分之一，具有抗病毒、降血脂、抗氧化等作用。梁連生等研究發(fā)現(xiàn)，甘肅黃芪黃酮類化合物可劑量依賴性抑制血管緊張素II（AngII）誘導的內(nèi)皮細胞凋亡，其機制或與降低被稱為死亡受體的Fas相關(guān)?？拱┓矫?，張冬青等研究表明，黃芪總黃酮及毛蕊異黃酮等都具有抑制人紅白血病K562細胞增殖的作用，可將細胞停滯在G0／G1 期，同時降低細胞內(nèi)Cyclin D1mRNA 水平，或是其抑制K562 細胞生長的主要作用機制。黃芪黃酮有效部位提取物可有效抑制S180 肉瘤生長，顯著提高血液及肝臟內(nèi)SOD 活性，降低血液及肝臟MDA 含量，可促進腫瘤細胞的凋亡。

1.4 清洗水中COD

化學需氧量（Chemical Oxygen Demand，COD）是指在嚴格的條件下水中的還原性物質(zhì)被氧化分解所消耗強氧化劑的量，反映水受還原性物質(zhì)污染的程度，包括有機物、亞硝酸鹽、亞鐵鹽、硫化物等還原性物質(zhì)，但一般水及廢水中無機還原性物質(zhì)含量較低，而有機物污染更普遍，因此COD 可作為有機物質(zhì)相對含量的一項綜合性指標。

2 分析方法的確定方法

2.1 高效液相色譜法分析測定黃芪皂苷Ⅳ

高效 液 相 色 譜 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一或混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。其應(yīng)用范圍廣、分析速度快、載液流速快，可分析80%以上有機物，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析更顯優(yōu)勢。通常分析一個樣品僅需幾分鐘到幾十分鐘，一般小于1 h。色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收。

HPLC 法具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度高等優(yōu)點，因此是黃芪甲苷含量測定中最為常用的一種分析方法。黃芪皂苷Ⅳ的HPLC 法測定應(yīng)用較廣，該法簡單可靠，專屬性好，C18色譜柱，常用的流動相為乙腈-水、甲醇-水、乙腈-水-磷酸、乙腈-水-四氫呋喃等，大多采用乙腈-水，但濃度比各有不同。UV 檢測器為最常用的檢測器，在檢測波長的選擇上，黃芪甲苷在近紫外區(qū)僅在200nm 左右處有弱的末端吸收，因此在200～210nm 左右選擇測定波長。通常選用201～203nm，波長小，吸收強，干擾較大；而波長大，干擾小，吸收強度又較差，經(jīng)衍生化的黃芪甲苷檢測波長為230nm。王宗權(quán)等采用HPLC-ELSD 法測定不同產(chǎn)地黃芪藥材中的黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪皂苷Ⅳ的含量。黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪皂苷Ⅳ的線性范圍較寬，平均回收率較高，重現(xiàn)性好。方法簡單快捷，適合于黃芪藥材中黃芪皂苷的含量測定研究，為尋找更佳黃芪產(chǎn)地提供了依據(jù)。史靜超等建立HPLC-ELSD 法測定黃芪中黃芪皂苷Ⅲ和黃芪皂苷Ⅳ的含量，采用C18色譜柱，乙腈-水為流動相。黃芪皂苷Ⅳ進樣量的自然對數(shù)與峰面積積分值的自然對數(shù)成良好線性關(guān)系，平均回收率較高、重現(xiàn)性好。方法簡便、準確，可用于黃芪的質(zhì)量控制。梁瑾等建立HPLC-DAD-ELSD法同時測定黃芪藥材中黃酮類和皂苷類成分的方法，比較15批不同產(chǎn)地的黃芪藥材中各有效成分的含量，采用HPLC-DAD-ELSD聯(lián)用法，乙腈-水為流動相。1 次進樣，同時測定黃芪藥材中毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅳ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪皂苷Ⅲ的含量，線性關(guān)系良好。平均回收率高。方法簡便，重復性好，可用于黃芪藥材中黃酮類和皂苷類成分的同時測定和黃芪藥材的質(zhì)量控制。王培培等研究黃芪藥材中黃芪皂苷的提取工藝及含量測定，采用薄層色譜法（TCL）、高效液相-示差檢測器法（HPLC-RID）進行皂苷類成分的鑒定和含量測定，從黃芪總皂苷中分離出六種黃芪皂苷化合物（ASⅠ-ASⅥ），ASⅢ部分經(jīng)鑒定主要含皂苷Ⅳ，質(zhì)量分數(shù)為22.82%。方法能較好的分離和純化黃芪皂苷，操作簡便，可作為黃芪皂苷的鑒定和含量測定方法。汪祺等建立黃芪中皂苷類成分的液相色譜特征圖譜。通過比較堿化處理前后皂苷類成分的變化，進一步證明堿性條件可以促使黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ轉(zhuǎn)化為黃芪皂苷Ⅳ，并確定黃芪皂苷Ⅰ至Ⅳ為特征成分且各成分分離良好，方法簡便易行，所選特征成分可用于黃芪中皂苷類成分的檢查。

因此，以HPLC 法進行黃芪皂苷Ⅳ含量測定，已經(jīng)是成熟、可靠的方法，本課題組擬采用HPLC法，對普通水清洗和不同超聲頻率和超聲強度的超聲波清洗后黃芪中黃芪皂苷Ⅳ的流失情況進行對比檢驗，并對普通清洗和超聲波清洗黃芪后洗滌水中各項含量進行對比檢驗，以確定超聲波清洗所需要的超聲頻率和超聲強度及超聲時間等。

2.2 紫外可見光譜法測定黃芪多糖和黃芪黃酮

紫外-可見吸收光譜法（UV-Vis）是利用物質(zhì)分子對10～800nm 光譜區(qū)的輻射吸收光譜進行分析測定的方法，廣泛用于有機、無機物的定性和定量測定。方法靈敏度、準確度較高，選擇性好，操作簡便快速。2.2.1 黃芪多糖的測定 黃芪多糖成分復雜，其含量的測定目前應(yīng)用較廣的為紫外-可見光譜法。苯酚-濃硫酸比色法是測定多糖含量較為經(jīng)典有效的方法之一，其原理是黃芪多糖在濃硫酸作用下水解生成單糖，并迅速脫水生成糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10～100 mg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，且在波長485 nm 下有特征吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。苯酚-硫酸法主要用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定。用苯酚-硫酸法測定黃芪多糖，對于黃芪多糖制劑的質(zhì)量控制將得到一定的保證。此外，方法操作簡單、試劑便宜、靈敏度高、具有實驗時基本不受蛋白質(zhì)存在的影響的優(yōu)點，且產(chǎn)生的顏色可穩(wěn)定160min以上。翟翠云等采用紫外光譜法（苯酚-硫酸法）對黃芪多糖進行含量測定試驗。表明該法在線性關(guān)系、重復性、回收率和穩(wěn)定性等方面令人滿意，可用于黃芪多糖的含量測定。涂波等探討了當歸補血湯顆粒中黃芪甲苷和黃芪多糖的含量測定方法。采用高效液相色譜法測定黃芪甲苷的含量，采用苯酚-硫酸比色法測定黃芪多糖的含量，旨在為自制的當歸補血湯顆粒質(zhì)量評價奠定基礎(chǔ)，結(jié)果表明，采用高效液相色譜法測定黃芪甲苷的含量，能實現(xiàn)黃芪甲苷與有關(guān)物質(zhì)的有效分離，黃芪甲苷峰形好，含量測定結(jié)果重復性好；所用測定黃芪多糖含量的苯酚-硫酸比色法，具有準確可靠、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，可用于評價當歸補血湯顆粒質(zhì)量的有效方法。張洪波等優(yōu)選黃芪葉提取的常規(guī)方法和超聲提取方法及確定黃芪多糖的含量測定方法，以超聲波提取方法及應(yīng)用苯酚-濃硫酸作顯色劑，采用紫外-可見光譜法進行含量測定。結(jié)論是超聲提取方法優(yōu)于常規(guī)提取方法；用紫外-可見光譜法測定含量，簡便快速，靈敏準確，適合黃芪多糖的含量測定。李孝棟等采用紫外光譜法測定黃芪中多糖的含量，通過對多糖部位的水溶部分、水不溶部分及二者混合物的多糖含量測定，表明水溶部分與水不溶部分總多糖的含量和二者混合物的多糖含量接近，結(jié)合多糖特性和Molish反應(yīng)的陽性現(xiàn)象，提出用沸水代替冷水對黃芪多糖有效部位萃提的方法更具準確性，研究結(jié)果證明苯酚-硫酸法也可用于測定水不溶多糖。

2.2.2 黃芪黃酮測定 皂苷和多糖存在較大差異。徐東生以黃芪為試材，用微波消解儀提取黃酮，含量的測黃芪黃酮成分復雜，其取適合于提取黃酮類和多糖類成分，連續(xù)回流法適合于提取皂苷類成分，3種黃芪中含有的黃酮定目前應(yīng)用較廣的為紫外可見光譜法。江蔚新等研究蒙古黃芪、膜莢黃芪和天然黃芪中皂苷、黃酮、多糖的質(zhì)量分數(shù)。采用連續(xù)回流提取法和超聲波提取法提取蒙古黃芪、膜莢黃芪和天然黃芪根中的皂苷、黃酮、多糖，比色法測定其質(zhì)量分數(shù)。結(jié)果表明，超聲波法提光度法測定其提取率，研究黃芪黃酮的最佳提取條件。表明各種因素對提取效果影響的順序為：提取溫度＞乙醇濃度＞料液比＞提取時間。郝紅梅等觀察酵母發(fā)酵對黃芪藥材中黃酮含量的影響。采用恒溫振蕩器對酵母菌懸液進行培養(yǎng)，利用紫外-可見光譜法對不同發(fā)酵時間下的藥材發(fā)酵液中的黃酮含量進行比較。結(jié)果表明發(fā)酵法黃芪黃酮的產(chǎn)率較對照組提高了18%，最佳發(fā)酵期為7d。

2.3 普通和超聲波清洗后洗滌水中COD 的測定

COD 測定方法主要有重鉻酸鹽法、高錳酸鉀法、分光光度法、快速消解分光光度法?？焖傧夥止夤舛确ǖ脑硎窃嚇蛹尤胍阎康闹劂t酸鉀，在強硫酸介質(zhì)中以硫酸銀催化劑高溫消解后，用光度法測定COD 值。該法測定時間短、二次污染小、試劑量小、費用低。為了檢驗黃芪在普通清洗和超聲波清洗后，總有機質(zhì)的流失程度，本課題組選擇快速消解分光光度法對普通清洗和不同超聲頻率、不同超聲強度的超聲波清洗后水中有機質(zhì)的含量（COD）進行測定，對比選擇和確定超聲波清洗的超聲頻率和超聲強度及超聲時間等。

3 小結(jié)

目前報道的黃芪的主要藥效和質(zhì)量標準成分為黃芪皂苷Ⅳ、黃芪多糖、黃芪黃酮等?；谝陨宵S芪各種主要有效成分的含量和重要藥理作用，以黃芪皂苷Ⅳ、黃芪多糖、黃芪黃酮的含量，以及清洗后水中化學耗氧量COD 的改變作為普通水洗和不同超聲頻率、不同超聲強度的超聲波清洗黃芪，有效成分散失與否和散失量的定性和定量分析檢測項目。初步選擇和確定的測定方法是采用高效液相色譜法測定黃芪皂苷Ⅳ，采用紫外可見光譜法測定黃芪多糖和黃芪黃酮。清洗水中總有機物含量（以COD 量計）采用快速消解分光光度法測定，為根類中草藥的超聲波清洗技術(shù)提供理論和實驗指導。

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