朱盛林 鄭玲利 袁明勇 趙霞

[摘要] 目的 研究微波提取附子中多糖的最佳條件。 方法 利用微波提取法，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，分別選取提取時間、提取溫度、料液比3個因素的3個水平進行Box-Benhnken中心組合設(shè)計，以多糖提取率為因變量，利用響應(yīng)曲面法對其提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化。 結(jié)果 最佳提取條件為：提取時間10 min，提取溫度80℃，料液比1∶20。在此條件下，附子多糖提取率為16.10%。 結(jié)論 該工藝簡便穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，可用于附子多糖的提取。

[關(guān)鍵詞] 附子；多糖；微波提取；響應(yīng)曲面法

[中圖分類號] R283 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（a）-0048-04

Optimization of microwave extraction of polysaccharides from Radix Aconiti Lateralis Praeparata by response surface methodology

ZHU Shenglin ZHENG Lingli YUAN Mingyong ZHAO Xia

Department of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College， Sichuan Province， Chengdu 610500， China

[Abstract] Objective To study the best condition of microwave-assisted extraction of polysaccharides from Radix Aconiti Lateralis Praeparata （Fuzi）. Methods Based on single factor experiment， a three-level， three-variable Box-Behnken design of response surface methodology adopting yield as response was applied in the optimization of the extracting parameters. Results The optimal conditions was determined as follows： extraction time was 10 min， extraction temperature was 80℃ and material/solvent ratio was 1∶20. Under the optimized conditions， the extraction yield of Fuzi polysaccharides was 16.10%. Conclusion The extraction technology can be used for the extraction of polysaccharides from Fuzi.

[Key words] Radix Aconiti Lateralis Praeparata； Polysaccharides； Microwave-assisted extraction； Response surface methodology

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品，中藥中“回陽救逆第一品”。附子中的主要化學成分有生物堿、多糖、苷類、甾醇、無機鹽等。研究表明，中藥多糖具有免疫調(diào)節(jié)[1]、抗腫瘤、抗感染、抗病毒、抗氧化[2-3]、抗輻射、降血糖、降血脂[4]、保肝等多種藥理作用。附子多糖無明顯毒性，其低毒性已受到人們的重視[5]。

作為水溶性化合物，附子多糖是中藥臨床使用中較大量的成分，因此，對其提取方法及含量的研究有重要意義。傳統(tǒng)的附子多糖的提取工藝研究，均采用煎煮方法[6-7]，可能會導(dǎo)致多糖部分水解。而微波輔助法提取多糖，可以縮短實驗和生產(chǎn)時間，同時還可以提高提取率及產(chǎn)品純度，并且節(jié)省溶劑。本試驗首次采用微波輔助提取法進行附子多糖的提取[8-9]，運用響應(yīng)面法[10]確定提取時間，提取溫度和料液比對于附子多糖提取率的影響，以獲得附子多糖提取最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料

調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、循環(huán)式真空水泵（鞏義市予華儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司）、離心機（上海安亭科學儀器制造廠）；紫外可見光光度計UV-1100型（上海美譜達儀器有限公司）等。附子購于四川江油（批號：20140219）、無水乙醇（批號：20130102）、苯酚（批號：20140221）、濃硫酸（批號：20130817）、三氯甲烷（批號：20131013）、正丁醇（批號：20131025）、蒸餾水，無水葡萄糖（批號：20140228）、鄰苯三酚（批號：20130822）、稀鹽酸（批號：20140418）、Tris（批號：20140308）等為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗多糖提取 附子用自來水清洗干凈，用蒸餾水漂洗2次，烘干至恒重，粉碎過60目篩，備用。取干燥的附子粉5 g，加入適量80%乙醇回流3 h脫脂，抽濾，藥渣揮盡乙醇。脫脂后藥渣浸泡于蒸餾水中30 min，放入微波爐中提取，濃縮提取液為20 mL，加入無水乙醇配置為80%的乙醇溶液，于4℃冰箱內(nèi)放置12 h后取出，4000 r/min離心5 min。棄上清液，依次用無水乙醇、乙醚清洗沉淀，得到粗多糖。

1.2.2 標準曲線的繪制

1.2.2.1 90%苯酚液的配制 準確移取苯酚90 mL，蒸餾水定容至100 mL，即得90%苯酚液。

1.2.2.2 6%苯酚液的配制 將90%苯酚液稀釋至6%，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2.3 繪制曲線 分別吸取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的0.1 mg/mL的葡萄糖標準液，置于10 mL試管中，各加水補足至2 mL，加入6%苯酚1 mL 搖勻，迅速滴加濃硫酸5 mL放置5 min，置沸水浴中加熱20 min，迅速冷卻至室溫，于490 nm處測吸光度。葡萄糖濃度為橫坐標X（μg/mL），吸光度為縱坐標Y，繪制標準曲線。

1.3 附子多糖含量測定

將提取得到的多糖20 mg用蒸餾水溶解，定容至100 mL，取溶解后的溶液0.2 mL，加蒸餾水1.8 mL，按標準曲線中的測定方法，以樣液為參比液，測定溶液的吸光值，按回歸方程計算待測溶液的多糖濃度[11-13]。含量（%）=（CDf/W）×100%（C為樣品液中葡萄糖的濃度，單位為mg/mL；D為稀釋因素；f為換算因子，單位為/mL；W為樣品質(zhì)量，單位為mg。得到f=1.71）。

1.4 單因素試驗

分別考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、提取溫度（60、70、80、90℃）及提取時間（5、10、15、20 min、）對附子多糖提取率的影響。

1.5 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選取單因素試驗3個因素中的各3個水平。利用Design-Expert軟件進行響應(yīng)曲面分析（RSM），進行Box-Behnken設(shè)計。編碼表如表1所示。采用SAS對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析[14]。求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程，對微波輔助提取附子多糖的影響因素進行篩選，并做出響應(yīng)面圖，建模及分析。

表1 響應(yīng)曲面試驗因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以吸光度為縱坐標，溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，由試驗結(jié)果得出回歸標準曲線方程：A=5.9508C+0.0002，R=0.9999。葡萄糖標準品在（0～0.16）mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗

2.2.1 時間對附子多糖提取率的影響

料液比為1∶5，溫度70℃，設(shè)置提取時間分別為5、10、15、20 min，考察提取時間對多糖提取率的影響，從圖1中可以看出，附子多糖提取率隨著提取時間的增加而增高，當提取時間增加到20 min時，多糖的提取率下降，可能是因為時間過久，多糖發(fā)生降解。

時間（min）

圖1 提取時間對附子多糖提取率的影響

2.2.2 溫度對附子多糖提取率的影響

提取時間為10 min，料液比為1∶20，溫度分別設(shè)置為60、70、80、90℃，考察溫度對附子多糖提取率的影響，從圖2中可以看出，在提取時間、料液比一定的前提下，附子多糖提取率隨著溫度的增加而增高。當溫度超過80℃時，提取率略微降低，因高溫可能對多糖的結(jié)構(gòu)和活性有一定影響。

溫度（℃）

圖2 溫度對附子多糖提取率的影響

2.2.3 料液比對附子多糖提取率的影響

溫度為70℃，時間為10 min，設(shè)置料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，考察料液比對附子多糖提取率的影響，從圖3中可知隨料液比的加大，提取率逐漸提高，超過1∶20時，提取率趨于穩(wěn)定。

2.3 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取提取時間、提取次數(shù)和料液比3個因素設(shè)計響應(yīng)面試驗，研究3個因素不同組合對多糖提取率的影響。試驗因素和水平及試驗結(jié)果見表2。

2.4 響應(yīng)面分析擬合回歸方程的方差分析

以附子多糖提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，各因素經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程：Y=16.72+0.38A-0.31B-0.26C-0.24AB-0.035AC-0.47BC-2.27A2-1.32B2-2.01C2。運用所建立的數(shù)學模型結(jié)果進行方差分析，回歸方程模型的F值為27.15，P值為0.0001，表明模型是非常顯著的。失擬項不顯著（P=0.8866），說明該模型是合理的，可以進行下一步的分析預(yù)測。由P值可知，在實驗范圍內(nèi)3個因素對提取率影響的大小順序為：料液比>提取時間>溫度。A、C、BC、A2、和C2對多糖提取率的影響顯著（P < 0.05）。A、B、C的交互作用大小為AC>BC>AB，R2=0.9467，則證明該模型可以解釋響應(yīng)值的變化有94.67%來源于所選變量即提取時間、提取溫度、料液比，自變量與響應(yīng)值之間有相互的對應(yīng)關(guān)系，說明該模型擬合程度較好，可以用來分析和預(yù)測多糖提取率。回歸分析結(jié)果見表3。

2.5 響應(yīng)曲面圖形分析

Design-Expert軟件處理得響應(yīng)面三維圖形見圖4～6。根據(jù)所得模型可以看出，隨著料液比的增加，提取率逐漸增加，但料液比在達到一定值后開始下降，而提取時間先降低后升高，通過分析得到最優(yōu)工藝參數(shù)：提取時間10.45 min，提取溫度78.85 ℃，料液比1∶19.74。在此條件下附子多糖的提取率為16.79%。

2.6 最優(yōu)工藝條件的確定及驗證

通過Design-Expert確定最佳工藝條件為：提取時間10.45 min，提取溫度78.85 ℃，料液比1∶19.74。在這樣的工藝條件，總黃酮提取率的理論值為16.79%。根據(jù)儀器及實驗條件，選取提取時間為10 min，提取溫度為80℃，料液比1∶20，進行重復(fù)驗證試驗，得到附子多糖提取率為16.10%，與理論值相對吻合，證明響應(yīng)面法得到的提取參數(shù)可靠。

3 討論

借助微波技術(shù)，通過響應(yīng)面分析法對附子多糖提取工藝進行優(yōu)化，建立了附子多糖提取率的二次多項數(shù)學模型，模型顯著，擬合情況良好。各因素對附子多糖提取率的影響次序為：料液比>提取時間>溫度；最優(yōu)工藝參數(shù)：提取時間10 min，提取溫度80℃，料液比為1∶20，提取率為16.10%，大大優(yōu)于傳統(tǒng)的煎煮提取方法，是一種很好的提取附子多糖的工藝條件。通過響應(yīng)面優(yōu)化法可以確定各因素及其交互作用在工藝過程中對響應(yīng)值的影響，精確表達因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，并為尋找最優(yōu)工藝條件并降低開發(fā)的時間和成本。此外，微波提取工藝能有效降低工藝條件的復(fù)雜性，而且消耗的能源和時間也較少，為附子綜合利用和附子多糖的產(chǎn)業(yè)化提供理論指導(dǎo)。接下來，本研究組將對采用該方法提取得到的附子多糖的結(jié)構(gòu)及活性做進一步的研究，以豐富附子水溶性成分的藥理結(jié)果。

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（收稿日期：2015-02-14 本文編輯：任 念）