王曉林，鐘方麗，徐靜，李艷秋

（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022）

猴腿蹄蓋蕨總黃酮的超聲提取工藝

王曉林，鐘方麗*，徐靜，李艷秋

（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022）

以提取得率為考察指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)探索了猴腿蹄蓋蕨總黃酮的超聲提取工藝條件。猴腿蹄蓋蕨總黃酮最佳的超聲提取條件為：料液比為1∶45（g/mL），乙醇濃度為60%，提取時(shí)間為105 min，提取次數(shù)為3次，在此條件下，猴腿蹄蓋蕨總黃酮的提取率為162.71 mg/g，說明超聲法可用于猴腿蹄蓋蕨總黃酮的提取，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

猴腿蹄蓋蕨；總黃酮；提取

猴腿蹄蓋蕨，俗稱猴腿，是一種山野菜，氨基酸含量豐富，屬于蹄蓋蕨科植物，廣泛分布于吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)[1]。猴腿蹄蓋蕨既可食用，又可藥用，是珍貴的藥食兩用山野菜，味甘、微苦、澀涼，具有安神、降壓、利尿、解熱鎮(zhèn)痛、驅(qū)風(fēng)濕、驅(qū)蟲、止血、治蛇蟲叮咬等功效，猴腿蹄蓋蕨既可在山上采摘，也可以進(jìn)行人工栽植，發(fā)展前景非常廣闊[2-4]。猴腿蹄蓋蕨主要含有黃酮、有機(jī)酸、蛻皮甾酮、萜類等多種活性物質(zhì)，其中黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌、抗病毒等多種活性。超聲波提取是利用超聲波空化作用加速植物有效成分浸出的提取，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、提取時(shí)間短、產(chǎn)率高、無需加熱，有利于保護(hù)熱不穩(wěn)定成分、省時(shí)、節(jié)能、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于玫瑰花、甘木通、廣金錢草等植物總黃酮的提取[5-8]。目前關(guān)于蕨類植物黃酮類成分的提取、純化、含量測(cè)定的研究已有公開報(bào)道[9-11]，而猴腿蹄蓋蕨總黃酮超聲提取工藝的研究尚未見報(bào)道，本課題采用超聲波法對(duì)猴腿蹄蓋蕨黃酮類成分進(jìn)行了提取工藝的研究，從而為更有效地開發(fā)猴腿蹄蓋蕨提供了參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

MAS-Ⅱ型超聲波提取儀：濟(jì)寧金百特電子有限公司；752N型紫外可見分光光度計(jì)、JY2002型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；W5-100SP型恒溫水浴鍋：上海申生科技有限公司；CS101-AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：中國(guó)重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D型循環(huán)水真空泵：河南省鞏義市英峪儀器一廠；蘆丁對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；猴腿蹄蓋蕨采自吉林市蛟河地區(qū)，經(jīng)吉林化工學(xué)院藥學(xué)系薛健飛博士鑒定為蹄蓋蕨科植物猴腿蹄蓋蕨；水為重蒸餾水；硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加入60%乙醇適量，超聲使其溶解，用60%乙醇定容，配制成濃度0.20 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。稱取干燥的猴腿蹄蓋蕨5 g，加入6倍量60%乙醇提取3次，每次2 h，合并濾液并定容于100 mL容量瓶中，即得供試品溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液各1.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，再加入4%NaOH溶液10 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑做空白，在波長(zhǎng)240 nm～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，供試品、對(duì)照品溶液在508 nm均出現(xiàn)吸收峰，所以選擇508 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取上述蘆丁對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，按1.2.1項(xiàng)下的方法，在508 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行直線回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12-13]，回歸方程為A=11.969C-0.001 25，R=0.999 9，結(jié)果表明蘆丁在0.0～0.048 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.3 樣品含量測(cè)定

精密吸取提取液適量，以相應(yīng)試劑為空白，照1.2.1項(xiàng)下的方法，于508 nm處測(cè)定吸光度，通過回歸方程計(jì)算出提取液中總黃酮的濃度，進(jìn)而計(jì)算出提取液中總黃酮的質(zhì)量和總黃酮提取率，計(jì)算公式如下：

總黃酮提取率（mg/g）=提取液中總黃酮的質(zhì)量（mg）/猴腿蹄蓋蕨的質(zhì)量（g）

1.2.4 猴腿蹄蓋蕨總黃酮的超聲提取實(shí)驗(yàn)

取猴腿蹄蓋蕨粉末2.5 g，置250 mL圓底燒瓶中，按規(guī)定加入不同體積不同濃度的乙醇水溶液，放入超聲機(jī)中并在設(shè)定溫度下按規(guī)定時(shí)間超聲提取，過濾，合并提取液，精密吸取上述提取液適量，按1.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定提取液總黃酮含量，計(jì)算總黃酮提取率。以猴腿蹄蓋蕨總黃酮提取率為指標(biāo)，分別考察料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)、乙醇濃度等因素對(duì)猴腿蹄蓋蕨總黃酮提取率的影響。在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，固定提取次數(shù)為3次，選擇料液比（1∶40、1∶45、1∶50）、提取時(shí)間（75、90、105 min）、乙醇濃度（55%、60%、65%）作為考察因素，按三因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

稱取猴腿蹄蓋蕨粉末2.5 g，設(shè)定料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL），加入濃度為45%的乙醇，超聲提取2次（每次60 min），過濾，合并提取液，按1.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定提取液中總黃酮的含量，計(jì)算出總黃酮提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effect of the ratio between raw material and solvent on extracting efficiency

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知總黃酮提取率開始隨溶劑量的增加而增加，在料液比達(dá)到1∶40 g/mL時(shí)，總黃酮的提取率已達(dá)到較高水平，在料液比達(dá)到1∶50時(shí)，提取率最高，再增加料液比，總黃酮提取率略有下降為了進(jìn)一步考察料液比對(duì)猴腿蹄蓋蕨總黃酮提取率的影響，選擇料液比分別為1∶40、1∶45、1∶50進(jìn)行正交試驗(yàn)。2.2超聲提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

稱取猴腿蹄蓋蕨粉末2.5g，料液比為1∶50（g/mL），加入濃度為45%的乙醇，超聲提取2次，每次分別提取30、60、90、120、150 min，過濾，合并提取液，按1.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定提取液中總黃酮的含量，計(jì)算出總黃酮提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of the extraction time on extracting efficiency

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)有所增加，在提取時(shí)間達(dá)到90 min時(shí)，提取率最高，之后提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)反而有所下降，分析原因可能是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，導(dǎo)致部分黃酮類化合物受到破壞所致。為了進(jìn)一步考察提取時(shí)間對(duì)提取率的影響，分別選擇提取時(shí)間為75、90、105 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 超聲提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響

稱取2.5g猴腿蹄蓋蕨粉末，料液比為1∶50（g/mL），加入濃度為45%的乙醇，超聲提取1、2、3、4、5次，每次90 min，分別過濾，濾液按1.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮的含量，計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見圖3。

圖3 提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of the extraction times on extracting efficiency

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取3次后總黃酮提取率達(dá)到總提取率的96.6%，所以固定超聲次數(shù)為3次。

2.4 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

稱取2.5g猴腿蹄蓋蕨粉末，料液比為1∶50（g/mL），分別加入濃度分別為30%、45%、60%、75%、90%的乙醇溶液，超聲提取3次，每次90 min，合并提取液，濾液按1.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮的含量，計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇濃度對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of the concentration of ethanol on extracting efficiency

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明提取率開始隨著乙醇濃度的升高而提高，在乙醇濃度為60%時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最高值，之后隨乙醇濃度的增加提取率明顯下降。為了進(jìn)一步考察乙醇濃度對(duì)提取率的影響，選擇乙醇濃度分別為55%、60%、65%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.5 正交試驗(yàn)

2.5.1 因素及水平的確定

正交試驗(yàn)的因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1The table of factors and levels

2.5.2 正交試驗(yàn)

稱取2.5 g猴腿蹄蓋蕨粉末，按L9（33）正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按1.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定提取液的吸光度，計(jì)算總黃酮提取率，確定超聲提取猴腿蹄蓋蕨總黃酮的最佳工藝，結(jié)果見表2。

由正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知猴腿蹄蓋蕨總黃酮的最佳提取工藝條件為A2B3C2，即料液比1∶45（g/mL）、乙醇濃度60%、提取3次、每次超聲105 min。由于提取時(shí)間處于第3水平，所以在進(jìn)行A2B3C2組合實(shí)驗(yàn)時(shí)，同時(shí)又進(jìn)行了A2B4C2（超聲120 min）組合實(shí)驗(yàn)，對(duì)上述兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較可知：A2B3C2組合的總黃酮提取率為160.78 mg/g，A2B4C2組合的總黃酮提取率為153.97 mg/g，所以選擇A2B3C2組合、提取3次為猴腿蹄蓋蕨總黃酮的最佳提取工藝。

2.6 超聲提取的工藝驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

稱取2.5 g猴腿蹄蓋蕨粉末，加入濃度為60%的乙醇，料液比為1∶45（g/mL），提取3次，每次105 min，合并提取液，濾液按1.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮的含量，計(jì)算總黃酮提取率。為了考察上述提取工藝的穩(wěn)定性，按此工藝條件提取3次，結(jié)果猴腿蹄蓋蕨總黃酮提取率分別為162.92、161.47、163.75 mg/g，平均為162.71 mg/g，說明經(jīng)過單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的猴腿蹄蓋蕨總黃酮超聲提取工藝穩(wěn)定可行。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2The data of orthogonal experiment

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)猴腿蹄蓋蕨總黃酮的超聲提取工藝進(jìn)行了探索研究，確定了其最佳提取工藝為料液比1∶45（g/mL）、乙醇濃度60%、提取3次、每次超聲105min，在該條件下，猴腿蹄蓋蕨總黃酮的提取率達(dá)到了162.71 mg/g，為猴腿蹄蓋蕨總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供了基本的依據(jù)。

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Study on Extraction Technology of Total Flavonoids from Athyrium Mult identatum（Doll.）Ching with Ultrasonic Method

WANG Xiao-lin，ZHONG Fang-li*，XU Jing，LI Yan-qiu
（School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，Jilin，China）

Using extracting efficiency of total flavonoids as evaluation indicator，the extraction technology of total flavonoids from Athyrium Mult identatum（Doll.）Ching with ultrasonic method was studied with single factor and orthogonal array experiments.The optimum extraction conditions of the ratio between material and solvent（m/v），extraction time，ethanol concentration，extraction time were 1∶45，105 min，60%，3 times respectively.The average extracting efficiency of total flavonoids could reach to 162.71 mg/g under the optimum conditions，which proved that ultrasonic method was suitable for the extraction of total flavonoids from Athyrium Mult identatum（Doll.）Ching.

Athyrium Mult identatum（Doll.）Ching；total flavonoids；extraction

2014-07-11

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.006

王曉林（1969—），男（漢），副教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物有效成分的提取及純化工藝研究。

*通信作者：鐘方麗（1970—），女（漢），教授，博士。