李卉

(西南大學(xué)動物科技學(xué)院 重慶 北碚400715)

多殺性巴氏桿菌是巴氏桿菌屬重要的致病菌，以其菌體抗原區(qū)分為16個血清型，菌體呈細(xì)小球桿狀或短桿狀，兩端鈍圓，在培養(yǎng)物中呈圓形、卵圓形或桿狀，瑞氏染色或美蘭染色可見明顯的兩極著色，為革蘭陰性菌。

1 毒力因子

1.1毒力因子概述

致病菌要成功侵襲宿主，首先要突破宿主機(jī)體防御系統(tǒng)，進(jìn)行吸附和侵入，并能在其中繁殖與擴(kuò)散，同時還要抵御宿主免疫系統(tǒng)的防御，這樣致病菌才能最終獲得存活所需的營養(yǎng)條件、定居下去。疾病發(fā)生一方面與宿主自身抵抗力和遺傳因素有關(guān)，另一方面受細(xì)菌毒力因子影響。有些毒力因子本身還具有免疫原性，可為研究防治疾病的疫苗提供理論基礎(chǔ)。

1.2毒力因子的歸納性對比

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)飛速發(fā)展，各種多殺性巴氏桿菌的毒力因子紛紛浮出水面，其中最主要的4種為莢膜、外膜蛋白、脂多糖、皮膚壞死毒素，而溶血素、胞外酶、透明質(zhì)酸酶[1]可能作為毒力因子，這里也作介紹。

眾多文獻(xiàn)采用逐一羅列的方式敘述毒力因子詳情，現(xiàn)總結(jié)為如下表格。

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以上毒力因子各有特點(diǎn)，細(xì)菌致病性的強(qiáng)弱是多種因子共同作用的結(jié)果。將它們分開來逐個細(xì)致研究，篩選出免疫原性較強(qiáng)的毒力因子，可推動高效亞單位疫苗的開發(fā)利用。

2 多殺性巴氏桿菌體內(nèi)表達(dá)基因技術(shù)

2.1體內(nèi)表達(dá)技術(shù)（IVET）

多殺性巴氏桿菌外膜蛋白基因分析的研究來源于基因的體內(nèi)表達(dá)技術(shù)（in vivo expression technology)，IVET體內(nèi)表達(dá)基因是指能在宿主體內(nèi)環(huán)境下表達(dá)，而在宿主體外環(huán)境不能表達(dá)的病原菌基因[8]。病原菌在宿主體內(nèi)、外生活環(huán)境差異明顯，細(xì)菌會對自身基因表達(dá)做出一系列適應(yīng)性改變。由于宿主體內(nèi)免疫反應(yīng)過程十分復(fù)雜，基因若在體外表達(dá)，就不能精準(zhǔn)重現(xiàn)宿主與細(xì)菌的相互關(guān)聯(lián)，所以IVET技術(shù)對于篩選出在宿主體內(nèi)被激活的基因具有顯著效果。

早在2001年，Mahan等人最先提出體內(nèi)表達(dá)技術(shù)(IV ET)，并用其來鑒定細(xì)菌體內(nèi)表達(dá)基因。Hunt等人[9]使用IVET技術(shù)通過建立禽多殺性巴氏桿菌體內(nèi)表達(dá)基因篩選系統(tǒng)，成功篩選到十幾個基因，并初步推測這些基因可能與細(xì)菌編碼外膜蛋白、催化生物新陳代謝的酶等功能有關(guān)。

2.2信號標(biāo)簽突變技術(shù)(STM)

STM是一種有效的負(fù)向選擇法，廣泛用于決定病原能否在宿主體內(nèi)成功定殖的基因篩選[10]。Ful ler等人[11]在2000年使用信號標(biāo)簽突變技術(shù)（STM）從牛多殺性巴氏桿菌中成功篩選出20多個體內(nèi)表達(dá)基因，并對這些基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了細(xì)致的功能預(yù)測。

2.3 DNA微陣列（DNA Microarray）技術(shù)

DNA Micmarray又名寡核苷酸陣列(Ol igonucleitide ar ray)[12]。該技術(shù)的基本原理是在固體表面上集成已知序列的基因探針，被測生物細(xì)胞或組織中大量標(biāo)記的核酸序列與上述探針陣列進(jìn)行雜交，通過檢測相應(yīng)位置雜交探針，實(shí)現(xiàn)基因信息的快速檢測[8]。2002年，Boyce等人[13]使用DNA微陣列技術(shù)，通過雛雞建立起自然感染模型，對禽多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了體內(nèi)表達(dá)基因的篩選研究，并提出理論——在宿主體內(nèi)高水平表達(dá)的病原菌基因很有可能就是其毒力基因。

2.4體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)（IVIAT）

IVIAT的基本原理是通過利用已感染過目標(biāo)病原的宿主血清來研究宿主體內(nèi)特異性表達(dá)的病原基因。Handfield等人[14]在研究空腔病原菌時發(fā)現(xiàn)了116個體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的抗原，并從中得到11個新的IVI基因，同時提出了IVIAT的概念。如今來看，應(yīng)用該技術(shù)對Pm體內(nèi)表達(dá)基因的篩選具有重要的借鑒意義。

3 展望

針對Pm雖已有多種疫苗成功取得效果并對疾病發(fā)展有一定控制，如多種滅活、弱毒菌苗、莢膜亞單位疫苗和高免血清等。但由于Pm血清型多達(dá)16種而疫苗免疫譜窄，只可對同型毒株有免疫效果，且保護(hù)期短，易出現(xiàn)耐藥性等原因，多殺性巴氏桿菌病仍在多地區(qū)時有發(fā)生。隨著毒力因子研究更加深入，構(gòu)建多價融合性外膜蛋白菌株或許為制備具交叉免疫保護(hù)性的亞單位疫苗指明了方向。與此同時，研究毒力因子的功能與特性、體內(nèi)表達(dá)基因的提取、鑒定和篩選等，對于闡明Pm致病機(jī)理有推動性作用，也促進(jìn)研制出高效、安全、廉價的疫苗，使控制多殺性巴氏桿菌病成為可能。

[1]蔡廣強(qiáng).多殺性巴氏桿菌毒力因子研究進(jìn)展,上海畜牧獸醫(yī)通訊[J].2013,6:7-9.

[2]Boyce J D，Adler B.The capsule is a virulence determinant in the pathogenesis of Pasteurel lamul tocida M1404(B:2)[J].Infect Immun，2000，68(6)：3463～3468.

[3]Galdiero M，F(xiàn)olgore A，Nuzzo，et a1.Adhesion and transmigration through bovine endothelial cel ls in vitro by protein Hand LPSof Pasteurel lamul tocida[J].Immuno，2004，202(3)：226～238.

[4]Ramdani，Adler B.Opsonic monoclonal antibodies against l i popol ysacchari de(LPS)antigens of Pasteurel la multocida and the role of LPSin immunity[J].Vet Microbiol，1991，26：335～347.

[5]Pratt J，Cooley JD，Purdy CW，et a1.Lipase activity f romst rains of Pasteurel la mul tocida [J].Curr MicrobioI，2000，40(5)：306～309.

[6]Negrete—Abascal E，Tenorio V R，de la Garza M.Secretion of proteases f rom Pasteurel la mul tocida isolates [J].Cur r Microbiol，1999，38(1)：6 4～6 7.

[7]Car ter GR，Chengappa MM.Hyaluronidase production by type B Pasteurel la mul tocida f rom cases of hemor rhagic septicemia[J].J Clin Microbiol，1980，11：94～96.

[8]黃先奇,沈愛梅,廖艷,葉鵬.多殺性巴氏桿菌體內(nèi)表達(dá)基因的研究進(jìn)展[J].畜禽業(yè),2011,10:34-35.

[9]Hunt,M.L.,D.J.Boucher,J.D.Boyce,and B.Adler.2001.In vivo-expressed genes of Pasteurel lamul tocida.Infect.Immun.69:3004-3012.

[10]赫明雷,劉思國.信號標(biāo)簽誘導(dǎo)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].專論與綜述,2008,9:5-6.

[11]Troy E. Ful ler, Michael J. Kennedy &David E. Lowery.Identi fication of Pasteurel la mul tocida virulence genes in a septicemic mouse modelusing signature-tagged mutagenesis.Microbial Pathogenesis[J],2000,29(10):25-38.

[12]Shalon,D.,1995.“DNAmicro arrays:A new tool for genetic analysis.”Ph.D.thesis,Stanford University,Stanford,CA.

[13]John D.Boyce,Ian Wi lkie,Marina Harper,etal.Genomic Scale Analysis of Pasteurel la multocida Gene Expression during Growth within the Natural Chicken Host[J].Infection and Immunity,2002,12(7):6871-6879.

[14]Handfield,M.,D.E.Lehoux,F.Sanschagrin,M.J.Mahan,D.E.Woods, and R. C. Levesque. 2000. In vivo-induced genes inPseudomonas aeruginosa.Infect.Immun.68:2359-2362.