譚滴清，潘衛(wèi)松 ，肖 瑛 ，馬景濤 ，孫永學(xué)，符路娣

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510405；2.廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣州510160；3.暨南大學(xué)，廣州510632；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州510642)

猴耳環(huán)水提物為棕黑色膏狀體，在廣東民間較為常用，其抗菌、抗炎作用在臨床用藥實(shí)踐中已得到證實(shí)，但目前研究對(duì)其作用機(jī)理尚未明確。據(jù)于猴耳環(huán)的眾多功效，本文擬通過(guò)建立小鼠免疫性肝損傷模型，觀察猴耳環(huán)水提物對(duì)小鼠免疫性肝損傷的血液生化指標(biāo)的影響，進(jìn)一步探討猴耳環(huán)水提物對(duì)免疫性肝損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠50只，體重18-22g，雄性，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（粵） 2013-0020。使用許可證編號(hào)：SYXK（粵） 2008-0001。

1.2 藥品與試劑 中藥猴耳環(huán)浸膏（批號(hào)：121105，含沒(méi)食子酸5.1%），由廣州萊泰制藥有限公司提供；環(huán)孢菌素A軟膠囊,由中美華東制藥公司提供；P.acnes菌株,由廣東省微生物菌種保藏中心提供；各種生化試劑盒,均由上海科華生物工程股份有限公司提供；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：150601-201174） ,由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.3 主要儀器 電子天平(型號(hào):AL204,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(型號(hào):MulitifugellR)；日立7060全自動(dòng)血生化分析儀。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將KM小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、P.acnes-LPS模型組、CsA組、猴耳環(huán)水提物高劑量組、猴耳環(huán)水提物低劑量組共5組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)第一天每只小鼠，尾靜脈注射8mg·kg-1熱滅活P.acnes生理鹽水溶液，試驗(yàn)第五天每只小鼠尾靜脈注射5ug/kg LPS-PBS溶液。P.acnes負(fù)荷前每天灌胃1次連續(xù)7d，用猴耳環(huán)水提物水溶液灌胃，其中高劑量給予5.82mg·kg-1，低劑量給予2.91mg·kg-1。末次給藥在LPS注射30min前，對(duì)照組給予等容量0.9%氯化鈉注射液。CsA從P.acnes負(fù)荷后一天起灌胃給藥，劑量為5mg·kg-1。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1 血液生化指標(biāo)檢測(cè) 在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采集各組小鼠血樣，使用離心機(jī)分離血樣（3000r/min,10min），采用全自動(dòng)化生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總蛋白（（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）。

1.5.2 肝臟組織學(xué)檢查 取小片肝組織于10%甲醛溶液中固定，HE染色，光鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以STATA 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±s表示,采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 猴耳環(huán)水提物對(duì)免疫性肝損傷小鼠血液生化指標(biāo)的影響

表1的結(jié)果顯示，模型組小鼠較正常組相比血清ALT水平明顯升高，不同劑量猴耳環(huán)水提物均可降低P.acnes-LPS負(fù)荷小鼠血清ALT水平,且呈一定量效關(guān)系。對(duì)照藥CsA也同樣顯著抑制因P.acnes-LPS負(fù)荷而引起的小鼠血清ALT活性的升高（P<0.05）。模型組小鼠血清TP含量減少、ALB含量下降、GLO升高。猴耳環(huán)水提物組小鼠血清中的ALB、TP有所下降，但與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。說(shuō)明本猴耳環(huán)水提物對(duì)免疫性肝損傷小鼠有一定的治療效果。

2.2 猴耳環(huán)水提物對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝臟組織病理學(xué)變化的影響

光鏡下正常小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列。模型組小鼠肝細(xì)胞呈較廣泛的嗜酸性壞死,肝組織鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹較明顯，胞漿疏松透亮，部分呈氣球樣變少數(shù)出現(xiàn)廣泛的肝細(xì)胞壞死,肝細(xì)胞濁腫有點(diǎn)狀壞死及小灶性壞死，可見(jiàn)散在的肉芽腫形成,匯管區(qū)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);CsA組小鼠肝組織切片見(jiàn)肝細(xì)胞普遍水腫，胞漿疏松但較模型組輕，未見(jiàn)肝細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等改變；猴耳環(huán)水提物高劑量組見(jiàn)肝細(xì)胞水腫改變較輕，未見(jiàn)肝細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等改變；猴耳環(huán)水提物低劑量組未見(jiàn)肝細(xì)胞水腫、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等表現(xiàn)。其中猴耳環(huán)水提物低劑量的肝細(xì)胞損傷程度最低。提示猴耳環(huán)水提物對(duì)P.acnes-LPS誘導(dǎo)的免疫性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

表1 猴耳環(huán)水提物對(duì)肝損傷小鼠血液ALT、AST、ALB、GLO、TP 水平的影響（X±s，n=10）

（圖1 各組小鼠光鏡下病理變化圖， 轉(zhuǎn)見(jiàn)第24 頁(yè)下方）

3 討論

猴耳環(huán)是一味較為名貴的中藥，其在治療上呼吸道感染，咽炎，咽喉炎，急性扁桃體炎，急性胃腸炎，細(xì)菌痢疾等方面具有良好的臨床效果。其葉、果實(shí)、種子：清熱解毒，涼血消腫，并可外用于燒燙傷、瘡瘍癰癤腫。全國(guó)中草藥匯編記錄其味功能微苦微澀，涼。清熱解毒，涼血消腫。外用于燒傷、燙傷、瘡癰癤腫。宋玉喬等[1]證實(shí)猴耳環(huán)中的槲皮苷能降低血壓、保護(hù)心肌缺血再灌注損傷，有抗氧化、清除氧自由基、增強(qiáng)免疫功能及抗癌、抗菌、抗病毒和鎮(zhèn)痛等作用。李藥蘭等[2]發(fā)現(xiàn)猴耳環(huán)中的沒(méi)食子酸甲酯成分具有較好的體外抗呼吸道合胞病毒（RSV） 活性。吳蓉蓉等[3]研究發(fā)現(xiàn)，猴耳環(huán)水提取物或醇提取物對(duì)流感病毒甲3型、副流感病毒1型、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒1和2型（HSV-1，HSV-2） 、腸道病毒CoxB3、鼻病毒（RV）、腮腺炎病毒均有抑制作用，且有很強(qiáng)的抗氧化活性。

猴耳環(huán)水提物功效之多，使其成為為提高免疫性肝損傷治療效果藥物的優(yōu)選研究藥物。而注射P.acnes和LPS可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫性肝損傷模型類似于人類肝炎發(fā)生的病理生理過(guò)程，是篩選保肝藥物較為理想的模型之一[4]。方士英等[5]研究證明由于P.acnes-LPS誘發(fā)肝損傷可以被CsA等免疫抑制劑所抑制，因此認(rèn)為P.acnes-LPS肝損傷模型近似自身免疫性肝炎的病理過(guò)程，其病變與慢性肝炎非常接近。

血液生化指標(biāo)能很好的地反映機(jī)體生理代謝狀態(tài)，也是機(jī)體新陳代謝機(jī)能的反映。因而臨床診斷上血液生化指標(biāo)便成為優(yōu)選診斷方式。大部分球蛋白具有免疫功能，免疫球蛋白在人體血清中具有抗體活性，能夠抗菌、抗病毒、加強(qiáng)細(xì)胞的吞噬作用，是引發(fā)機(jī)體體液免疫的重要物質(zhì)[6]，GLO含量的高低在一定程度上反映了動(dòng)物機(jī)體免疫功能的好壞。ALT在肝臟中的含量最為豐富，只分布于細(xì)胞漿中，ALT升高，就提示肝細(xì)胞發(fā)生了損傷，是醫(yī)學(xué)上肝功能檢査的指標(biāo)。AST在提示肝細(xì)胞損傷方面靈敏度不如ALT，因?yàn)槠渲饕嬖谟诟渭?xì)胞的線粒體之屮，而ALT主要存在線粒體之外。只有在嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷時(shí)，線粒體膜才會(huì)受損，從而AST濃度才會(huì)升高。

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中P.acnes-LPS染毒小鼠可引起肝組織損傷導(dǎo)致血清ALT活性升高，通過(guò)猴耳環(huán)水提物治療后小鼠血清ALT活性降低。對(duì)照藥CsA也同樣顯著抑制因P.acnes-LPS負(fù)荷而引起的小鼠血清ALT活性的升高（P<0.05）。模型組小鼠血清TP含量減少、ALB含量下降、GLO升高。猴耳環(huán)水提物組小鼠血清中的ALB、TP有所下降但，各組TP、ALB、GLO含量差異不顯著（P>0.1）。顯示猴耳環(huán)水提物不是直接影響機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的利用程度及對(duì)血液滲透壓，此次試驗(yàn)中ALB對(duì)組織的修補(bǔ)能力不顯著。肝臟組織學(xué)顯示猴耳環(huán)水提物可一定程度的改善肝組織的病理學(xué)變化。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了本猴耳環(huán)水提物對(duì)P.acnes-LPS致小鼠免疫性肝損傷小鼠有一定的治療效果。

[1]宋玉喬,姚凌云,曹蔚,等.槲皮素的藥理作用研究近況[J].西北藥學(xué)雜志,2002(01):40-42.

[2]李藥蘭,李克明,蘇妙賢,等.猴耳環(huán)抗病毒有效成分研究[J].中國(guó)中藥雜志,2006(05):397-400.

[3]吳蓉蓉,黃杰昌,雷佳,等.猴耳環(huán)提取物的新用途:2006-10-25

[4]Nigam SK,Mitra CR.Pithecolobium dulce.IV.Constituentsof flowers,heartwood and rootbark.[J].Planta Medica,1968,16(3):335-337.

[5]方士英,徐茂紅,葉良兵,等.冬蟲(chóng)夏草對(duì)免疫性肝損傷小鼠模型的保護(hù)作用研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2011(10):891-894.

[6]AktasO,Zipp F.Regulation ofSelf-Reactive TCellsby Human Immunoglobulins-Implications forMultiple SclerosisTherapy[J].CurrPharm Des,2003,9(3):245-256.

圖1 各組小鼠光鏡下病理變化圖（X100 倍）