王玲玲, 吳志偉

(信陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000)

0 引言

還原氧化石墨烯(Gr)是由碳原子單層通過(guò)共價(jià)鍵合的一種六方對(duì)稱二維晶體，厚度僅為0.335 nm，而比表面積理論值則達(dá)到2 630 m2/g[1-3]，是目前備受研究者關(guān)注的一種新型二維碳材料.由于Gr具有大的比表面積，且機(jī)械性能優(yōu)良、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，其對(duì)物質(zhì)的吸附主要是基于π-π電子之間的相互作用及其疏水性，被證明是一種很好的固相萃取吸附劑.但是，由于單純的Gr易于聚集，作為萃取柱填料容易造成塌陷，堵塞柱子，從而使得萃取效率下降.因此對(duì)于石墨烯進(jìn)行表面修飾非常必要.硅膠是由二氧化硅的無(wú)定形體構(gòu)成的非晶型的多孔狀物質(zhì)，具有性質(zhì)穩(wěn)定、耐酸、不易碎、不溶脹等優(yōu)點(diǎn)，是一種良好的吸附劑材料[4-5].但是硅膠的顆粒一般較大，比表面積較小，因此限定了它的應(yīng)用.

本文通過(guò)水熱法，將還原性石墨烯與硅膠相結(jié)合制備了兩者的復(fù)合物用作固相萃取柱的填料.該復(fù)合物結(jié)合了石墨烯和硅膠兩者的優(yōu)點(diǎn)，具有機(jī)械性能好、不易坍陷、比表面積大、吸附力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn).磺胺類藥物是獸藥的一種，常殘留于食品中，通過(guò)食物鏈富集于人體中，對(duì)人的健康造成危害[6-7].在本工作中我們將該新型萃取柱與高效液相色譜法相結(jié)合， 成功地測(cè)定了牛奶中的磺胺類藥物殘留，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫1200高效液相色譜儀，安捷倫C18分離柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和1 mL固相萃取小柱；日立公司S4800掃描電子顯微鏡；KQ50E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Mettler Toledo DELTA 320 pH計(jì)(瑞士梅特勒-托利多公司).

石墨粉、肼、氨水、硅膠等均購(gòu)于上海試劑廠；磺胺類(對(duì)羧基苯磺酰胺SMB、磺胺嘧啶SDZ、磺胺甲基嘧啶SMR、磺胺甲噁唑SMZ、鄰甲基苯磺酰胺O-T)和3-氨丙基三乙氧基硅烷購(gòu)于上海晶純?cè)噭┕荆?種磺胺類物質(zhì)分別溶于乙酸-甲醇的混合溶液中，配制成1 g/L的儲(chǔ)備液，在4 ℃下儲(chǔ)存.

1.2 還原氧化石墨烯-硅膠復(fù)合物的制備

首先采用Hummers方法制備氧化石墨[8-9].分別將3 g石墨粉、2.5 g (NH4)2S2O8和2.5 g P2O5加入到80 ℃的12 mL濃硫酸中，恒溫4.5 h后，冷卻，用水稀釋后放置12 h.經(jīng)過(guò)過(guò)濾、洗滌、烘干后得到預(yù)氧化石墨.將氧化石墨加到120 mL的濃硫酸中，在冰浴下緩慢加入15 g的KMnO4，攪拌均勻.然后升溫至35 ℃，攪拌2 h后逐滴加入250 mL水，并在50 ℃下攪拌2 h.用水稀釋后，加入100 mL的30%的過(guò)氧化氫至產(chǎn)物呈亮黃色并產(chǎn)生氣泡.將所得的混合物抽濾并用10%的HCl和水反復(fù)洗滌，干燥后得氧化石墨.在氧化石墨中加入適量蒸餾水，超聲至溶液呈現(xiàn)均一透明狀，得到氧化石墨烯水溶液.

將5.0 g 60目硅膠置于6 mol/L HCl中加熱回流4 h，冷卻后過(guò)濾，洗滌至中性，并在80 ℃下烘干.加入75 mL甲苯，加熱至回流，再逐滴加入5 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流12 h后，冷卻，抽濾， 80 ℃下烘8 h后加入150 mL氧化石墨烯水溶液，再加入2.5 g N, N- 二環(huán)己基碳酰亞胺，回流24 h，抽濾，洗滌，烘干.稱取上述產(chǎn)物0.2 g置于圓底燒瓶中，加入100 mL的蒸餾水，加熱回流，加入0.2 g NaBH4，繼續(xù)回流12 h，抽濾，洗滌，烘干后得到還原氧化石墨烯-硅膠復(fù)合物.

所制備的還原氧化石墨烯和還原氧化石墨烯-硅膠復(fù)合物的掃描電鏡圖如圖1中的A和B所示.由A圖可以看到石墨烯典型的片狀褶皺結(jié)構(gòu)，在B圖中可以看到硅膠和石墨烯緊密地結(jié)合在一起.

圖1 還原氧化石墨烯(A)和還原氧化石墨烯-硅膠復(fù)合物(B)的掃描電子顯微鏡圖Fig. 1 SEM images of reduced graphene (A) and reduced graphene-silica gel composites

1.3 固相萃取柱的制備

將商品化的1 mL的固相萃取小柱上篩板取出，倒出柱填料，取20 mg還原氧化石墨烯-硅膠復(fù)合物填入柱中，蓋上上篩板.柱子在使用前分別用5 mL的蒸餾水與甲醇活化.萃取結(jié)束后，柱子分別用甲醇與蒸餾水洗滌即可進(jìn)行下次進(jìn)樣.

1.4 色譜條件及樣品制備

對(duì)色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化，確定如下分離條件：色譜柱為C18分離柱，流動(dòng)相為甲醇-乙酸混合溶液(pH 3.2)，體積比為27∶73，流速為1 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm.

牛奶為蒙牛牌純牛奶(無(wú)菌包裝).將鐵氰化鉀與牛奶混合液置于100 mL錐形瓶中，再加入5 mL硫酸鋅，攪拌均勻后加熱到75 ℃，直至牛奶中蛋白質(zhì)大量沉淀.然后向混合溶液中加入10 mL乙腈，并超聲一段時(shí)間，最后通過(guò)0.2 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，得到的濾液轉(zhuǎn)移到容量瓶中，4 ℃下保存?zhèn)溆?

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件優(yōu)化

磺胺類藥物在不同溶劑中的溶解度差異較大，因此需要對(duì)溶劑進(jìn)行優(yōu)化.分別考察了乙腈、乙醇、甲醇、堿性甲醇、酸性甲醇這5種有機(jī)溶劑對(duì)5種磺胺類藥物洗脫能力的影響.結(jié)果表明，當(dāng)5種磺胺類藥物的濃度為100 μg/L，且溶液體積為50 mL時(shí)，乙腈、乙醇和甲醇3種洗脫液基本沒(méi)有出峰，說(shuō)明洗脫效果不好.而酸性甲醇和堿性甲醇洗脫液的信號(hào)峰較強(qiáng)，但堿性甲醇洗脫液中有雜質(zhì)峰存在，干擾檢測(cè)，而且硅膠在堿性條件下易溶解，對(duì)色譜柱造成損害，因此選擇酸性甲醇為洗脫劑.

考察了洗脫劑的體積對(duì)萃取效率的影響.當(dāng)酸性甲醇的量小于0.1 mL時(shí)，不足以覆蓋萃取填料，所以洗脫劑使用最小量選擇為0.1 mL.將洗脫劑0.1 mL逐漸增加到0.6 mL.所得結(jié)果如圖2所示，隨著洗脫劑的增多，峰面積逐漸減小，所以選擇0.1 mL的酸性甲醇為洗脫劑.

圖2 洗脫劑體積的影響Fig. 2 The effect of elution volume

考察了樣品溶液的體積對(duì)峰面積的影響.分別測(cè)試了6個(gè)不同體積(25、50、75、100、125、150 mL)的樣品溶液.所得結(jié)果如圖3所示.對(duì)于5種磺胺類藥物，當(dāng)溶液體積由25 mL增大到75 mL時(shí)，它們的峰面積隨之增大.而當(dāng)樣品溶液超過(guò)75 mL時(shí)，其峰面積隨之減少.因此選擇75 mL為最佳樣品溶液體積.

圖3 樣品體積的影響Fig. 3 The effect of samples volume

由于磺胺類物質(zhì)的溶解度受pH影響較大，所以樣品溶液的pH也是影響萃取效率的重要因素.在pH 3～8范圍內(nèi)考察了樣品溶液pH對(duì)的各個(gè)磺胺類藥物峰面積的影響，結(jié)果如圖4所示.綜合考慮后，選擇pH 5為最佳溶液pH值.

圖4 樣品溶液pH的影響Fig. 4 The effect of samples pH value

酸性甲醇中乙酸和甲醇的含量比也影響洗脫效率.如圖5所示，通過(guò)改變兩者的比率，得到的各個(gè)磺胺類藥物的峰面積也不一樣，當(dāng)乙酸體積與甲醇的體積比為1∶1.5時(shí)，所得到的各個(gè)藥物的峰面積最大，因此選擇該比率配置洗脫液.

圖5 乙酸與甲醇體積比的影響Fig. 5 The effect of the ratio of methanol to acetic acid

2.2 分析參數(shù)

在上述的優(yōu)化條件下，利用固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定了不同濃度的磺胺類藥物，5種分析物的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖如圖6所示，從圖中可以看出5種物質(zhì)得到了良好的基線分離.所建立的分析方法的線性范圍、檢測(cè)限(LOD)、相關(guān)系數(shù)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等相關(guān)參數(shù)如表1所示.

圖6 五種磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖 樣品溶液pH:5，樣品溶液體積:50 mL， 各物質(zhì)濃度均為25 μg/L，洗脫劑:0.2 mL的酸性甲醇.Fig. 6 The chromatogram of five sulfonamides表1 分析方法的分析參數(shù)Tab. 1 Analytical parameters of the developed method

分析物線性方程線性范圍/(μg·L-1)相關(guān)系數(shù)RSD/ %日內(nèi)(n=5)日間(n=3)LOD/(μg·L-1)SMBy=0.095 0x + 0.972 80.1～1000.977 14.35.10.078SDZy=0.213 4x + 1.186 40.1～1000.995 56.98.40.078SMRy=0.535 3x + 0.784 20.1～750.984 93.34.20.057SMZy=1.001 1x + 3.946 40.1～750.996 05.28.10.027O-Ty=0.081 4x + 3.820 10.1～750.984 76.310.30.026

2.3 實(shí)際樣品分析

按實(shí)驗(yàn)部分對(duì)牛奶樣品進(jìn)行預(yù)處理，然后將不同濃度的磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品加入到處理好的牛奶樣品中，用所建立的新方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示.回收率在88.3%～113.6%之間，說(shuō)明所建立的方法可用于實(shí)際樣品分析.

3 結(jié)論

本文將還原氧化石墨烯-硅膠復(fù)合材料作為新型固相萃取吸附劑與高效液相色譜法相結(jié)合用于磺胺類藥物分析，該方法展現(xiàn)出收率高，重現(xiàn)性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn).并且萃取柱的制備簡(jiǎn)單、成本低、操作簡(jiǎn)便，可用于實(shí)際樣品分析.

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab. 2 The results of the covery test