張相飛 杜春華 郝雙紅 李凌緒

摘要：陳皮石油醚提取物中富含對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌（Valsa mali）具有抑菌活性的物質(zhì)，研究通過(guò)反復(fù)硅膠柱層析、制備高效液相色譜、重結(jié)晶對(duì)餾分F15純化獲得了3個(gè)活性單體A、B、C。核磁共振數(shù)據(jù)顯示A、B、C分別為3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素和川陳皮素。采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定A、B、C的抑菌活性，結(jié)果表明，3個(gè)化合物對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌的EC50分別為68.19、1.56、24.02 μg/mL，其中橘皮素對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌的抑菌活性最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：陳皮；蘋(píng)果腐爛病菌（Valsa mali）；多甲氧基黃酮；分離純化；抑菌活性

中圖分類號(hào)：S432.9+8；S482.2+92 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）13-3150-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.020

Research of Active Material in Petroleum Ether Extraction from Tangerine Peel

for in Vitro Control of Valsa mali

ZHANG Xiang-feia，DU Chun-huaa，HAO Shuang-honga，LI Ling-xub

（a.College of Chemistry and Pharmaceutical Science； b.College of Agronomy and Plant Protection， Qingdao Agricultural University，

Qingdao 266109， Shandong，China）

Abstract： Petroleum ether extraction from tangerine peel was rich in active ingredients against Valsa mali. Research through purification obtained three active monomers A，B，C by repeated silica gel column chromatography，the preparation of high performance liquid chromatography and recrystallization on fraction F15. Monomeric compounds A，B and C were determined as 3，5，6，7，8，3′，4′-heptamethoxyflavone， tangeretin and nobiletin，respectively. Growth rate method was used to determine the bacteriostatic activity of A，B，C. The results showed that all the three monomeric compounds were strong inhibitors against Valsa mali and the EC50 were 68.19，1.56 and 24.02 μg/mL respctively. Among them tangeretin had strongest antifungal activity against Valsa mali.

Key words： tangerine peel； Valsa mali； polymethoxyflavones； separation； antifungal activity

蘋(píng)果樹(shù)腐爛病是一種由蘋(píng)果腐爛病菌（Valsa mali）引起的毀滅性的病害，主要為害主枝主干，在中國(guó)蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)的總體發(fā)生率為52.7%，造成巨額損失[1]。化學(xué)防治是目前生產(chǎn)上防治蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的主要手段，但現(xiàn)有的化學(xué)農(nóng)藥很難有效控制蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的發(fā)生與危害，亟需開(kāi)發(fā)新型的農(nóng)藥。天然產(chǎn)物因其活性高、結(jié)構(gòu)新穎被視為新型農(nóng)藥先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。陳皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulate Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，含有揮發(fā)油、黃酮、生物堿、肌醇等活性成分，具有理氣健脾、燥濕化痰的功能[2，3]。同時(shí)陳皮中也富含具有抑制霉菌作用的活性物質(zhì)[4-7]，本課題組的前期研究表明陳皮脂溶性成分具有強(qiáng)烈的抑制蘋(píng)果腐爛病菌生長(zhǎng)的活性[8，9]。本研究擬在活性追蹤的指導(dǎo)下對(duì)陳皮提取物的石油醚相進(jìn)行分離純化，明確其中對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌具有抑菌活性的化學(xué)成分，為開(kāi)發(fā)防治蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的新型農(nóng)藥提供先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 供試材料

陳皮于2011年7月購(gòu)自青島市城陽(yáng)區(qū)富康大藥房，產(chǎn)地為浙江黃巖。陳皮在室內(nèi)陰干，磨粉備用。

1.2 供試菌種

供試植物病原菌為蘋(píng)果腐爛病菌，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院提供。

1.3 儀器設(shè)備

核磁共振儀為Bruker AV-500型。高效液相色譜儀為天津科器高新技術(shù)公司YZS-3型（ODS C18柱，40 mm×300 mm，10～30 μm）。柱色譜用100～200目硅膠及薄層色譜硅膠H均購(gòu)自青島海洋化工公司。

1.4 化合物的提取、分離與純化

取陳皮粉末3 kg加入9 L的75%乙醇60 ℃提取3 h，過(guò)濾收集濾液。重復(fù)提取3次后合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，得陳皮粗提物126.37 g。粗提物經(jīng)石油醚萃取，得石油醚相24.85 g。取石油醚相20 g經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚∶乙酸乙酯梯度（100∶0→100∶1→20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1→1∶100）洗脫，經(jīng)TLC（薄層色譜法）分析后合并相同組分，共獲得15個(gè)餾分，編號(hào)為F01-F15。F15經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析分離，用石油醚∶乙酸乙酯（3∶1）洗脫獲得F1501、F1502、F1503共3個(gè)組分。F1502經(jīng)中壓制備HPLC（高效液相色譜法）分離，流動(dòng)相為乙腈，UV（紫外光）檢測(cè)器，波長(zhǎng)255 nm，流速15 mL/min，獲得化合物A（保留時(shí)間26 min）32 mg和化合物B（保留時(shí)間21 min）21 mg。F1503經(jīng)丙酮重結(jié)晶獲得化合物C共81 mg。

1.5 抑菌活性測(cè)定方法

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定15個(gè)餾分及單體化合物的抑菌活性，試驗(yàn)過(guò)程中所用培養(yǎng)基、玻璃制品等均經(jīng)滅菌。稱取適量餾分或單體化合物，用少量丙酮溶解，加入到已融化的60 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，搖勻，倒入直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基冷卻凝固后移入生長(zhǎng)一致、直徑為4 mm的蘋(píng)果腐爛病菌菌餅。以加入等量丙酮的培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿置于27 ℃恒溫培養(yǎng)，至對(duì)照接近長(zhǎng)滿菌時(shí)采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，抑菌率計(jì)算公式為：

抑菌率=（對(duì)照組菌落純生長(zhǎng)量—處理組菌落純生長(zhǎng)量）/對(duì)照組菌落純生長(zhǎng)量×100%

使用SPSS20.0的Probit模型進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出不同化合物的EC50和毒力方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同餾分對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌的抑菌活性

陳皮乙醇提取物的石油醚萃取相經(jīng)硅膠柱層析后共獲得了15個(gè)餾分，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定了不同餾分對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌的抑菌作用，濃度為200 mg/mL時(shí)各餾分的抑菌作用如表1所示。由表1可知，石油醚相中的活性成分主要存在于高極性部分，其中餾分F15對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌的抑菌率最高，為（96.73±1.36）%，抑菌活性最強(qiáng)，因此優(yōu)先對(duì)餾分F15進(jìn)行了分離純化。

2.2 化合物結(jié)構(gòu)表征

化合物A為無(wú)色至黃綠色針狀結(jié)晶（乙腈），熔點(diǎn)129～130 ℃。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.816（1H，s，H-2′），7.016（1H，s，J=8.5 Hz，H-5′），7.845（1H，d，J=8.5 Hz，H-6′），4.104（3H，s，OCH3），4.010（3H，s，OCH3），3.979（9H，s，3×OCH3），3.954（3H，s，OCH3），3.894（3H，s，OCH3）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：152.985（C-2），140.619（C-3），173.738（C-4），148.069（C-5），143.713（C-6），151.166（C-7），137.692（C-8），146.635（C-9），114.955（C-10），123.307（C-1′），110.839（C-2′，C-5′），150.910（C-3′），148.617（C-4′），121.792（C-6′），62.176、61.837、61.743、61.562、59.728（3-、5-、6-、7-、8-C），55.865、55.777（3′、4-C′）。其核磁共振氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮一致[10，11]。故推斷化合物A為3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮，分子式為C22H24O9，分子量為432。

化合物B為無(wú)色針狀結(jié)晶（乙腈），熔點(diǎn)50～51 ℃。1H-NMR（CDCl3，500 MHz） δ：6.613（1H，s，H-3），7.884（2H，d，J=7.2Hz，H-2′，H-6′），7.033（2H，d，J=6.8Hz，H-3′，H-5′），4.108（3H，s，OCH3），4.026（3H，s，OCH3），3.955（6H，s，2×OCH3），3.896（3H，s，OCH3）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：162.333（C-2），106.776（C-3），177.301（C-4），144.127（C-5），138.145（C-6），151.386（C-7），148.445（C-8），147.758（C-9），114.973（C-10），123.956（C-1′），127.734（C-2′，C-6′），114.556（C-3′，C-5′），161.183（C-4′），62.258、62.021、61.820、61.647（5-、6-、7-、8-C），55.510（4′-C）。其1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致[12，13]，故鑒定為5，6，7，8，4′-五甲氧基黃酮（橘皮素，紅橘素，Tangeretin），分子式為C20H20O7，分子量為372。

化合物C為無(wú)色至黃綠色針狀結(jié)晶（丙酮），熔點(diǎn)134～135 ℃。1H-NMR（CDCl3，500MHz） δ：6.628（1H，s，H-3），7.414（1H，s，H-2′），6.999（1H，d，J=8.2Hz，H-5′），7.575（1H，d，J=8.5Hz，H-6′），4.110（3H，OCH3），4.030（3H，OCH3），3.984（3H，OCH3），3.971（3H，OCH3），3.958（3H，2×OCH3）；13C-NMR（CDCl3，125MHz）

δ：160.896（C-2），106.776（C-3），177.226（C-4），143.961（C-5），137.886（C-6），151.298（C-7），147.597（C-8），148.309（C-9），114.744（C-10），123.890（C-1′），108.387（C-2′），149.152（C-3′），151.783（C-4′），111.079（C-5′），

119.491（C-6′），62.152、61.855、61.726、61.572（5-、6-、7-、8-C），55.973、55.851（3′-、4′-C）。其核磁共振碳譜、氫譜數(shù)據(jù)與5，6，7，8，3′，4′-六甲氧基黃酮（川陳皮素，Nobiletin）一致[10，14]。

2.3 單體化合物活性測(cè)定

為了明確石油醚相中的抑菌活性成分，采用反復(fù)硅膠柱層析、重結(jié)晶、制備HPLC等方法對(duì)餾分F15進(jìn)行了進(jìn)一步的分離純化，獲得了3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素、川陳皮素等3個(gè)活性單體?；钚詼y(cè)定結(jié)果表明3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素、川陳皮素對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌的EC50分別為68.19、1.56、24.02 μg/mL（表2），橘皮素可能是石油醚相中對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌產(chǎn)生抑菌活性的主要成分。

3 小結(jié)與討論

陳皮是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，其來(lái)源為蕓香科柑橘屬植物柑橘的果皮，富含黃酮等活性成分。多甲氧基黃酮（Polymethoxyflavones，PMFs）主要存在于蕓香科植物中，相比黃酮苷，其分子空間構(gòu)型更具平面性，極性更小，更容易穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)活動(dòng)。PMFs因其良好的抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎等活性受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[15-17]。同時(shí)PMFs也是柑橘果實(shí)貯存期重要的抗病物質(zhì)，在果實(shí)采摘后可抵抗柑橘青霉菌（Penicillium digitatum）[15，18]、柑橘褐腐疫霉病菌（Phytophthora citrophthora）[19，20]等病菌的侵染，且其抗侵染能力與其含量呈正相關(guān)[21]。但PMFs對(duì)其他植物的病原菌是否有抑菌活性少有報(bào)道，Almada-Ruiz等[22]曾從柑橘的冷榨油中分離得到了4個(gè)多甲氧基黃酮類化合物，體外活性試驗(yàn)證實(shí)3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素、川陳皮素等對(duì)膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）都有較好的活性，其中橘皮素和川陳皮素在100 μg/mL時(shí)均可完全抑制膠孢炭疽菌的生長(zhǎng)。本研究從陳皮乙醇提取物的石油醚相中分離得到了3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素、川陳皮素等3個(gè)多甲氧基黃酮類化合物，活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)其對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌均有很強(qiáng)的抑菌活性，EC50分別為68.19、1.56和24.02 μg/mL。朱蔚等[23]從柑橘皮乙醇提取物中獲得了5個(gè)多甲氧基黃酮類化合物，并評(píng)價(jià)了其抑菌活性，在濃度為1 000 μg/mL時(shí)川陳皮素和橘皮素對(duì)茶樹(shù)云紋葉枯病菌并沒(méi)有明顯的抑制生長(zhǎng)活性（抑菌圈直徑小于10 mm），這可能與川陳皮素及橘皮素的抑菌譜有關(guān)。

由蘋(píng)果腐爛病菌侵染引起的蘋(píng)果樹(shù)腐爛病在中國(guó)分布廣、危害重，是北方蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)的第一大病害。蘋(píng)果樹(shù)腐爛病防治困難，目前的藥劑難以取得理想的效果。橘皮素等多甲氧基黃酮類化合物對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌有較好的抑菌活性，可作為開(kāi)發(fā)高效新型藥物的先導(dǎo)化合物。

參考文獻(xiàn)：

[1] 雍道敬，李保華，王彩霞.蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌不同致病力菌株對(duì)蘋(píng)果的誘導(dǎo)效應(yīng)[J].植物生理學(xué)報(bào)，2014，50（6）：810-816.

[2] 趙小艷，呂武清.陳皮的研究概況[J].中國(guó)藥業(yè)，2006，15（15）：68-70.

[3] 歐立娟，劉啟德.陳皮藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2006， 17（10）：787-789.

[4] 雷 鋼，王永強(qiáng)，張雅軍，等.柑橘皮浸膏的防霉、飼養(yǎng)效果研究[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001（4）：51-54.

[5] 趙寶玉，李紹君，王軍亮，等.桔皮提取物抑制霉菌試驗(yàn)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，1998，19（2）：30-33.

[6] 馬慶一，陳春濤，荊曉艷，等.橙皮苷等橘皮活性成分的提取和抑菌作用研究[J].食品科學(xué)，2004，25（12）：112-115.

[7] 嚴(yán)贊開(kāi)，胡春菊.橙皮甙的抑菌效果研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13（2）：87-89.

[8] 李凌緒，魏 艷，杜春華，等.橘皮提取物對(duì)7種農(nóng)業(yè)植物病原真菌的抑菌活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（30）：13242-13243.

[9] 李凌緒，曲亮亮，孟昭禮.橘皮色素的抑菌活性[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（1）：80-82.

[10] HAMDAN D，EL-READI M Z，TAHANI A，et al. Chemical composition and biological activity of Citrus jambhiri Lush[J].Food Chemistry，2011，127（2）：394-403.

[11] 錢(qián)士輝，陳 廉.陳皮中黃酮類成分的研究[J].中藥材，1998，21（6）：301-302.

[12] 楊武亮，陳海芳，余金寶，等.枳殼化學(xué)成分研究[J].中藥材，2008，31（12）：1812-1815.

[13] CHEN J，Antonio M. M， Wilbur W. Tow new polymethoxylated flavones，a class of compounds with potential anticancer activity，isolated from cold pressed dancy tangerine peel oil solids[J]. Journal of Agriculture and Chemistry，1997，45：364-368.

[14] 趙雪梅，葉興乾，席嶼芳，等.胡柚皮中的黃酮類化合物[J].中草藥，2003，34（1）：11-13.

[15] ORTU？譙O A，B？魣IDEZ A，G？魷MEZ P，et al. Citrus paradisi and Citrus sinensis flavonoids：Their influence in the defence mechanism against Penicillium digitatum[J]. Food Chemistry，2006，98（2）：351-358.

[16] 車(chē) 震，康 娜，郝東寧，等.多甲氧基黃酮對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（33）：6471-6474.

[17] 王 磊，蘇學(xué)素，付陳梅，等.柑橘中多甲氧基黃酮生物活性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2009，30（7）：285-290.

[18] ARCAS M C，BOT？魱A J M，ORTU？譙O A M，et al. UV irradiation alters the levels of flavonoids involved in the defence mechanism of Citrus aurantium fruits against Penicillium digitatum[J]. European Journal of Plant Pathology，2000，106（7）：617-622.

[19] DEL R？魱O J A，G？魷MEZ P，BAIDEZ A G，et al. Changes in the levels of polymethoxyflavones and flavanones as part of the defense mechanism of Citrus sinensis（cv.Valencia Late）fruits against Phytophthora citrophthora[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（7）：1913-1917.

[20] DEL R？魱O J A，ARCAS M C， BENAVENTE-GARC？魱A O，et al. Citrus polymethoxylated flavones can confer resistance against Phytophthora citrophthora，Penicillium digitatum， and Geotrichum species[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46（10）：4423-4428.

[21] ORTU？譙O A，ARCAS M C，BOT？魱A J M，et al. Increasing resistance against Phytophthora citrophthora in tangelo Nova fruits by modulating polymethoxyflavones levels[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（10）：2836-2839.

[22] ALMADA-RUIZ E，MART？魱NEZ-T？魪LLEZ M ？魣，HERN？魣NDEZ-？魣LAMOS M M，et al. Fungicidal potential of methoxylated flavones from citrus for in vitro control of Colletotrichum gloeosporioides，causal agent of anthracnose disease in tropical fruits[J].Pest Management Science，2003，59（11）：1245-1249.

[23] 朱 蔚，高旭輝，秦金花，等.柑橘皮乙醇提取物中抑菌成分的分離與鑒定[J].植物保護(hù)，2013，39（4）：61-64.

收稿日期：2014-11-15

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2010CQ026）

作者簡(jiǎn)介：張相飛（1981-），男，山東萊陽(yáng)人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事農(nóng)藥學(xué)研究，（電話）15953259290（電子信箱）88121029@qq.com；

通信作者，李凌緒，（電話）13455276690（電子信箱）lingxulipvi@126.com。