鄒曉華等

[摘要] 目的 建立感冒熱毒清合劑中連翹苷的高效液相色譜（HPLC）法含量測(cè)定方法。 方法 對(duì)處方中連翹進(jìn)行定性鑒別，并對(duì)連翹苷進(jìn)行HPLC法測(cè)定，采用色譜柱資生堂SHISEIDO CAPCELL PAK MG-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動(dòng)相乙腈-水（76∶24），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm。 結(jié)果 連翹苷在6.88～137.6 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r = 0.9992），連翹苷的平均回收率為99.20%、99.96%、98.73%。 結(jié)論 本文首次建立了感冒熱毒清合劑中連翹苷的HPLC含量測(cè)定方法，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為感冒熱毒清合劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

[關(guān)鍵詞] 感冒熱毒清合劑；連翹苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）05（c）-0117-04

[Abstract] Objective To establish a method on content determination of phillyrin in Ganmao-reduqing Mixture by high performance liquid chromatography （HPLC）. Methods Phillyrin was performed qualitative identification. The content of phillyrin in mixture was determined by HPLC with a SHISEIDO CAPCELL PAK MG-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）， acetonitrile-water （76∶24） was used as mobile phase and the flow rate was 1.0 mL/min. The columm temperature was set at 30℃ and the wavelength of the detector was set at 277 nm. Results The linear range for phillyrin was 6.88-137.6 μg/mL and the correlation cofficient was 0.9992. The average recovery of phillyrin was 99.20%， 99.96%， 98.73% respectively. Conclusion This is the first time to establish a method using HPLC for determination of phillyrin in Ganmao-reduqing Mixture. The method is accurate， reproducible and suitable to be used for quality assessment of Ganmao-reduqing Mixture.

[Key words] Ganmao-reduqing Mixture； Phillyrin； High performance liquid chromatography； Content determination

感冒熱毒清合劑（南制字2011F19001）是解放軍第一一七醫(yī)院結(jié)合長(zhǎng)年的臨床實(shí)踐，并進(jìn)行處方篩選而研制成的適合臨床、治療感冒效果好、質(zhì)量穩(wěn)定的純中藥制劑。該合劑由連翹、板藍(lán)根、金銀花等組成，連翹具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱；用于癰疽，瘰疬，乳癰，丹毒，風(fēng)熱感冒，溫病初期，溫?zé)崛霠I(yíng)，高熱煩渴，神昏發(fā)斑，熱淋澀痛[1-2]。連翹苷為連翹中主要成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)和臨床研究表明連翹中的連翹苷具有抗菌、抗病毒、強(qiáng)心、抑制毛細(xì)血管通透性、抗肝損傷等作用[3]。感冒熱毒清合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有性狀、鑒別、檢查等檢驗(yàn)項(xiàng)目，但沒(méi)有建立組方中主要成分的含量測(cè)定方法，隨著中藥制劑的發(fā)展，對(duì)中藥制劑的質(zhì)量提出了更高要求[4-7]。本文選取連翹苷為指標(biāo)成分，連翹苷為連翹中的主要成分，建立高效液相色譜法含量測(cè)定方法[2，8-16]，該方法穩(wěn)定性及重復(fù)性較好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為醫(yī)院制劑-感冒熱毒清合劑的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀LC-20A型（日本島津）、電子天平AE240（瑞士Mettler）、HH-S數(shù)控恒水浴鍋（金華市文華科教實(shí)驗(yàn)儀器廠）、KQ-400DB型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

感冒熱毒清合劑供試品（解放軍第一一七醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號(hào)：20140218、20131220、20140401、20140117、 20131024），連翹苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110821-201213）、正丁醇為分析純（天津市永化化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120507），氨水為分析純（浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130901）。甲醇、乙腈均為色譜純（德國(guó)Merck公司，批號(hào)：20140114）。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

取感冒熱毒清合劑20 mL，加水飽和的正丁醇提取2次，每次15 mL，合并正丁醇液，加氨試液20 mL和水20 mL洗滌，棄去水層，正丁醇層水浴蒸干，殘?jiān)右掖? mL溶解，作為供試品溶液。另取連翹苷對(duì)照品，加乙醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-冰醋酸（8.5∶1∶0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105℃烘至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2 定量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 連翹苷的色譜條件：色譜柱為資生堂SHISEIDO CAPCELL PAK MG-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相乙腈-水（76∶24），檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，理論板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于3000。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取連翹苷對(duì)照品3.44 mg，加入25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即為連翹苷對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取感冒熱毒清合劑樣品50 mL，加水飽和的正丁醇50 mL萃取2次，合并2次的正丁醇層溶液，加氨試液50 mL洗滌，棄去水層，正丁醇層置80℃水浴蒸干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容至刻度，作為連翹苷含量測(cè)定的供試品溶液。按處方比例及工藝制備不含連翹的陰性對(duì)照溶液適量，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 專屬性考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照品溶液在連翹苷峰相應(yīng)的保留時(shí)間附近無(wú)干擾峰出現(xiàn)，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取連翹苷對(duì)照品溶液，進(jìn)行梯度稀釋，注入液相色譜儀各10 μL，記錄連翹苷峰面積。以連翹苷濃度（X）為橫坐標(biāo)，連翹苷峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y = 14787X-60772，r = 0.9992，結(jié)果表明，連翹苷對(duì)照品濃度在6.88～137.6 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取連翹苷對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果平均峰面積的RSD = 1.80%，表明儀器精密度良好。精密吸取連翹苷對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果平均峰面積的RSD = 0.99%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為20140218的感冒熱毒清合劑，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于常溫條件放置0、4、8、12、24 h后，分別進(jìn)樣20 μL，記錄連翹苷的峰面積。結(jié)果RSD = 1.31%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn) 按照“2.2.3”供試品溶液制備方法，將同一批次，批號(hào)為20131220樣品平行制備5份供試品溶液，分別測(cè)定連翹苷的含量。結(jié)果RSD = 1.24%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的感冒熱毒清合劑適量，共9份，每份10 mL分別精密加入高、中、低濃度的連翹苷對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定并計(jì)算連翹苷加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.10 樣品含量測(cè)定 取感冒熱毒清合劑5批樣品（批號(hào)：20140218、20131220、20140401、20140117、20131024），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀中進(jìn)行連翹苷含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

連翹為本合劑處方中的主要成分，連翹有效成分連翹苷具有極強(qiáng)的抗菌、抗病毒活性，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用比四環(huán)素強(qiáng)，是迄今為止連翹屬植物中發(fā)現(xiàn)的抗菌活性最強(qiáng)的成分之一，為中藥連翹的主要特征性成分。連翹酚對(duì)金黃色葡萄球菌、志賀菌也有一定的抑菌作用。連翹還可直接破壞內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)，以消除或減輕細(xì)菌毒素引起的休克等各種中毒癥狀[2]。對(duì)連翹進(jìn)行定性及含量測(cè)定極其重要。

以薄層色譜法對(duì)連翹進(jìn)行定性鑒別實(shí)驗(yàn)，把連翹中的有效成分連翹苷作為對(duì)照品，陰性樣品同時(shí)作比較。經(jīng)文中的展開(kāi)劑和乙酸乙酯-甲醇-水（10∶2∶1）為展開(kāi)劑展開(kāi)，供試品色譜均在連翹苷相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)；而陰性樣品色譜在連翹苷相應(yīng)位置不顯此斑點(diǎn)，證明其他成分無(wú)干擾，具有鑒別專屬性。含量測(cè)定方法結(jié)合《中國(guó)藥典》中連翹的含量測(cè)定方法和文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定連翹中連翹苷的含量，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇277 nm，理論板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。感冒熱毒清合劑成分復(fù)雜，在供連翹苷含量測(cè)定用的供試品溶液制備過(guò)程中，采用正丁醇萃取，氨水洗滌并濃縮的方法，該方法可去除合劑中其他成分對(duì)連翹苷在高效液相色譜圖上的干擾。

本研究對(duì)感冒熱毒清合劑中的連翹苷進(jìn)行定性鑒別及含量測(cè)定，建立了連翹指標(biāo)成分的含量測(cè)定方法，該方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為醫(yī)院制劑-感冒熱毒清合劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同批號(hào)樣品中連翹苷含量有差別，這是由于藥材具有較廣的分布區(qū)，不同地區(qū)居群往往具有不同的基因型，其原因除與各個(gè)地方的生態(tài)環(huán)境等自然因素有關(guān)外，還有可能受栽培技術(shù)、采收時(shí)間、產(chǎn)地加工等因素影響。研究表明，不同產(chǎn)地連翹中有效成分的含量差異較大，原材料產(chǎn)地、采集時(shí)節(jié)不同，存放時(shí)間及條件不同，對(duì)合劑中的連翹苷含量有較大影響[17-20]。因此，該合劑的質(zhì)量控制應(yīng)嚴(yán)格從源頭抓起，即嚴(yán)格把握原藥材的質(zhì)量。

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（收稿日期：2015-02-19 本文編輯：李亞聰）