張向陽等

[摘要] 目的 觀察胃癌組織中微小RNA-181a（miR-181a）與其靶基因共濟失調(diào)-毛細血管擴張突變基因（ATM）的表達與異常情況，初步研究其意義。 方法 收集2009年4月～2011年12月廣州市第一人民醫(yī)院外科手術切除的胃癌組織標本9例，同時選取其癌旁非癌組織標本作為對照，分析胃癌組織中miR-181a與ATM蛋白表達的相關性。提取其蛋白質(zhì)及總RNA，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測標本的miR-181a，Western blot檢測ATM蛋白。比較胃癌組織及癌旁非癌組織中miR-181a、ATM蛋白表達量。 結(jié)果 miR-181a在胃癌組織中的表達量為（1.981±1.800），miR-181a在鄰近非癌組織中的表達量為（0.394±0.093）；灰度值檢測：癌組織ATM蛋白為（0.2539±0.0046）；非癌組織為（0.5525±0.0660），癌及非癌組織中miR-181a、ATM蛋白表達量比較，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；miR-181a與ATM蛋白表達呈負相關（r=-0.539，P < 0.01）。 結(jié)論 miR-181a在胃癌組織中表達明顯增高，ATM蛋白表達明顯下降；究其原因可能是通過基因沉默機制miR-181a降低ATM蛋白表達量，從而在胃癌的發(fā)生及發(fā)展中起促進作用。

[關鍵詞] 共濟失調(diào)-毛細血管擴張突變基因；胃癌；微小RNA；miR-181a

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）05（c）-0024-05

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of microRNA （miRNA）-181a （miR-181a） and its target gene ATM in gastric carcinoma tissues. Methods Tissues of gastric carcinoma and adjacent non-tumorous were collected respectively from 9 patients given surgical operation in Guangzhou First People's Hospital from April 2009 to December 2011. The total RNA and protein were extracted routinely， the miR-181a was detected by Real-time quantitative PCR， ATM protein was detected by Western blot. The expression of miR-181a and ATM protein between gastric carcinoma and adjacent non-tumorous were compared， and the correlation between miR-181a and ATM protein levels in gastric carcinoma was analyzed. Results In gastric carcinoma tissues， the expression of miR-181a and ATM protein were （1.981±1.800）， （0.2539±0.0046） respectively， whereas in the adjacent non-tumorous tissues， the expression of miR-181a and ATM protein were （0.394±0.093）， （0.5525±0.0660） respectively. The differences between the expression of miR-181a and ATM protein in these two tissues were statistically significant （P < 0.01）. There was a negative correlation between miR-181a and ATM protein levels （r=-0.539， P < 0.01）. Conclusion The expression of miR-181a is significantly up-regulated in gastric carcinoma tissues， whereas the ATM protein is markedly decreased. miR-181a may inhibit ATM expression by post-transcriptional gene silencing to restrain gastric carcinoma occurrence and progress.

[Key words] ATM； Gastric cancer， micro-RNA； miR-181a

微小RNA（microRNA）是一類非編碼小分子 RNA，存在于真核生物中，長度約為22個核苷酸，有高度的進化保守性，以堿基互補配對原則與靶基因mRNA結(jié)合，從而引起靶基因mRNA的降解或抑制靶基因mRNA的翻譯，進而在轉(zhuǎn)錄后完成對基因表達的調(diào)控，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中作為一類潛在的癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用[1-2]。作為miR-181家族新成員，miR-181a是近期才發(fā)現(xiàn)的一個micro-RNA，它在胸腺細胞中表達上調(diào)，而在人白血病K562細胞及神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達下調(diào)，在許多疾病中，如慢性淋巴細胞性白血病、非小細胞肺癌和惡性膠質(zhì)瘤等諸多疾病的研究方面較多且較為深入，但在胃癌研究方面的報道甚少。共濟失調(diào)-毛細血管擴張癥突變基因（Ataxia-telangiectasia mutated gene，ATM）被認為是一種抑癌基因[3-5]，ATM的基因突變增加癌癥患者的易感風險，最初的研究在乳腺癌和胃癌[4，6-7]和ATM蛋白能抑制人類乳腺上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化[8]。ATM和P53都是參與細胞周期檢查點調(diào)節(jié)的癌癥易感基因[9-10]，在DNA損傷反應時，這個350 kD的蛋白激酶在G1、S、G2期至關重要[7，11]。此基因產(chǎn)物被認為參與并加強了P53在基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)亡和DNA損傷修復方面的功能[4，12]。ATM功能缺失損害其維持DNA穩(wěn)定性的功能，從而導致癌變，這可能由于ATM基因突變，啟動子甲基化，激酶失活造成[5-6，8]。磷酸化的ATM（活性形式）在胃癌組織中的表達下調(diào)[5]，而大多數(shù)人的正常組織（包括胃）包含ATM的非磷酸化形式[13]。盡管目前研究觀察到在胃癌組織中有ATM基因的表達下降，但其隱含的深層次的作用機制仍不明了。本研究觀察了miR-181a與ATM蛋白在胃癌組織中的表達情況，為研究miR-181a與其靶基因ATM存在的深層次的調(diào)控關系提供了充分的實驗依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象

選取2009年4月1日～2011年12月1日廣州市第一人民醫(yī)院外科手術切除的胃癌標本9例，同時選取其癌旁非癌組織標本作為對照。通過病理專家確定所選胃癌標本均為中晚期胃癌，且入選患者術前均未行放、化療等治療。配對的癌旁非癌組織取其距胃癌癌灶邊緣5 cm以上，術后經(jīng)液氮速凍保存在-80℃冰箱。本研究經(jīng)廣州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會通過，所有患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 靶基因的預測

運用3個生物信息學預測軟件，預測miR-181a的靶基因。MiRanda、PicTar及TargetScan。

1.3 引物設計及合成

在miRNA Base數(shù)據(jù)庫和GeneBank數(shù)據(jù)庫中基因序列的查找，引物設計采用Primer express 2.0軟件。內(nèi)參照U6及miR-181a由丹麥生物工程公司Exiqon設計、合成。

1.4 檢測miR-181a

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術。用Trizol提取總RNA，95 μL RNase-free ddH2O加總RNA 5 μL（總RNA可稀釋20倍），應用紫外分光光度計，選擇RNA為測定參數(shù)，稀釋倍數(shù)設為20倍，調(diào)零校正用比色皿中加100 μL RNase-free ddH2O，稀釋后的總RNA在比色皿中實施定量檢測，樣本OD260/OD280的比值可同時檢測。若OD260/OD280=1.9～2.1則提示純度很好；OD260/OD280<1.9則提示DNA有污染；若OD260/OD280>2.1提示有部分標本降解。總RNA完整性的檢測：用凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的28、18 s和5 s 3個條帶，總RNA抽提較完整則3個條帶完整。第一鏈互補DNA（cDNA）的合成：qRT-PCR采用MJ Research系列qRT-PCR儀，Opticon Monitor 2為操作系統(tǒng)，按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（EXIQON公司）的操作說明，qRT-PCR試劑購自EXIQON公司（丹麥），采用標準曲線法。根據(jù)反應體系中得到的Ct值，分別計算出9例胃癌組織和配對的癌旁非癌組織中的miRNAs的相對拷貝數(shù)（2-ΔΔCt），相對值=癌組織的校正值/非癌組織的校正值，校正值=目的基因定量結(jié)果/內(nèi)參U6定量結(jié)果。

1.5 ATM蛋白檢測

應用免疫印跡（Western blot）方檢測法ATM蛋白，具體方法：稱取100 mg組織標本，放置于高壓滅菌后的研缽上，液氮研磨成組織勻漿，后加1 mL蛋白提取液，經(jīng)超聲破碎5 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，收集總蛋白。測定蛋白濃度：取總蛋白50 μg，加凝膠上樣緩沖液，100℃加熱5 min使蛋白完全變性。分離蛋白并原位電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉處理該膜后，分別與ATM一抗及二抗[Rabbit Anti-Mouse IgG （H+L），稀釋倍數(shù)：1∶4000]和GAPDH優(yōu)質(zhì)內(nèi)參（HRP標記）孵育。最后顯影。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；采用Spearman相關系數(shù)進行相關性分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

在胃癌組織中miR-181a的表達量為（1.981±1.800），在鄰近非癌組織中miR-181a的表達量為（0.394±0.093）（圖1）；ATM蛋白在癌組織中的灰度值為（0.2539±0.0046），癌旁非癌組織灰度值為（0.5525±0.066）（圖2）。miR-181a、ATM蛋白在癌及非癌組織中的表達量比較，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）（圖3）。miR-181a與靶基因ATM蛋白的表達呈負相關（r=-0.539，P﹤0.01）（圖4） 。

3 討論

近年來越來越多的實驗研究表明，miRNA在人類多種惡性腫瘤性疾病中多有異常表達[14-16]。然而對胃癌組織中miRNA的異常表達及作用機制，目前還不甚清楚。為更深入了解在腫瘤性疾病發(fā)病中miRNA發(fā)揮的作用，尋找腫瘤特異性較高的miRNA及它們對應的靶基因，學者們進行了大量的卓有成效的工作，可為惡性腫瘤的治療提供新的方法[14，17]。

本研究組前期實驗中通過應用miRNA的基因芯片技術及實時熒光定量聚合酶鏈反應技術，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多在胃癌組織中表達異常的miRNA，miR-181a為其中之一。此前已有兩項研究報道在胃癌組織顯中miR-181a的高表達[18-19]，然而在胃癌發(fā)病中miR-181a的作用仍未闡明。有研究顯示miR-181a在以下疾病中是下調(diào)的：人類原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤[1，20]、慢淋白血病[21]、急髓白血病[22-23]、非小細胞肺癌[24]和口腔鱗狀細胞癌[25]，同時認為miR-181a充當癌癥抑制基因，可與K-ras[25]、BCL-2[26-27]、PLAG1[22]結(jié)合，而發(fā)揮其抑癌效應。在乳腺癌[28]、肝細胞癌[2]、多發(fā)性骨髓瘤[29]、甲狀腺乳頭狀癌[30]中發(fā)現(xiàn)miR-181a高表達，同時作為致癌，與靶基因如OPN[31]、CDX2、GATA6、NLK[2]、RASSF1A、TIMP3[32]、PCAF[29]、THRB[30]和uPA[33]結(jié)合而發(fā)揮作用。在胃癌組織中，與其配對的癌旁非癌組織比較，miR-181a表達顯著上調(diào)，提示在胃癌發(fā)病過程中miR-181a可能作為一個重要的癌基因而參與其中。之前本研究在人胃癌細胞株SGC-7901細胞中，用miR-181a Inhibitor（抑制質(zhì)粒）和陰性對照質(zhì)粒，進行了沉默表達miR-181a的研究。通過進行細胞凋亡、細胞增殖、克隆形成、流式細胞、細胞遷移和侵襲等實驗研究，結(jié)果提示沉默miR-181a的表達可顯著抑制SGC-7901細胞的增殖活性，也可明顯抑制SGC-7901細胞的遷移及侵襲能力，同時可促進SGC-7901細胞的凋亡，但與細胞周期無關。鑒于miR-181a在胃癌組織及胃癌細胞株（SGC-7901細胞）中表達均有上調(diào)，本研究推斷miR-181a表達的下調(diào)可抑制胃癌細胞的惡性表型。

ATM基因被廣泛認為是一種與P53相提并論的重要的抑癌基因[3-5]，ATM的基因突變增加癌癥患者的易感風險。此基因產(chǎn)物被認為參與并加強了P53在基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)亡和DNA損傷修復方面的功能[4，12]。ATM功能缺失損害其維持DNA穩(wěn)定性的功能，從而導致癌變，這可能由于ATM基因突變、啟動子甲基化，激酶失活造成[5-6，8]。磷酸化的ATM（活性形式）在胃癌組織中的表達下調(diào)[5]，而大多數(shù)人的正常組織（包括胃）包含ATM的非磷酸化形式[13]。盡管目前在胃癌組織中ATM基因的研究較多，但其下調(diào)的機制仍無統(tǒng)一的共識，而通過本研究發(fā)現(xiàn)了miR-181的表達上調(diào)，并在轉(zhuǎn)錄后水平抑制ATM基因的表達可能是其作用機制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-181a在胃癌組織中的表達上調(diào)，而ATM基因在胃癌組織中表達下調(diào)。miR-181a在胃癌組織中的表達和ATM基因的表達呈負相關，miR-181a通過對ATM基因的負性調(diào)控，使其對胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移潛能產(chǎn)生影響?；谶@些結(jié)論，結(jié)合是個研究組前期的研究成果，聯(lián)系了miR-181a與胃癌增殖及轉(zhuǎn)移潛在的相關性及ATM基因與miR-181a表達水平之間的負性相關。本研究認為：在胃癌發(fā)病復雜的過程中，先有miR-181a的高表達（相當于癌基因激活）引起了ATM蛋白的表達下調(diào)（相當于抑癌基因失活），從而影響了胃癌細胞功能變化，如遷移、侵襲、增殖和凋亡等（基因沉默），從某種程度上導致了胃癌的發(fā)生及發(fā)展，由此推斷出在胃癌發(fā)病過程中miR-181a起致癌基因作用，其和靶基因ATM基因的鑒定，對了解胃癌發(fā)生及發(fā)展的分子機制有很大的幫助，從而為人類治療胃癌提供一個理想的靶標。

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（收稿日期：2015-02-22 本文編輯：任 念）