摘要：利用已構(gòu)建的過表達(dá)擬南芥（Arabidopsis）GEF7基因植株，在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并與野生型植株進(jìn)行對比分析，對GEF7基因過表達(dá)植株的幼苗表型進(jìn)行了觀察分析。結(jié)果表明，GEF7基因過表達(dá)植株幼苗的根長比野生型對照明顯增加；其子葉形態(tài)、數(shù)目和幼苗形態(tài)等方面均有異常表型，表明GEF7基因的功能與根的發(fā)育有關(guān)，并參與調(diào)控植物的發(fā)育過程。

關(guān)鍵詞：擬南芥（Arabidopsis）；GEF7基因；根；植物生長發(fā)育

中圖分類號：Q945 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2511-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.056

Rac/ROP GEFs（Guanine nucleotide exchange factor）稱為Rac/ROP鳥嘌呤核苷酸交換因子，是小G蛋白Rac/ROP的上游活化因子，能催化小G蛋白由GDP結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為GTP結(jié)合態(tài)。Rac/ROP作為一種分子開關(guān)調(diào)節(jié)植物多種生長發(fā)育以及參與多種信號途徑，其中包括調(diào)節(jié)花粉管的生長、根毛的發(fā)育、過氧化氫的產(chǎn)生以及參與生長素、脫落酸等植物激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[1]。擬南芥基因組中存在14個Rac/ROP GEFs基因，是近年來鑒定的一個新的基因家族[2]。關(guān)于植物Rac/ROP GEFs生物學(xué)功能的研究目前比較少，僅有Rac/ROP GEFs調(diào)控?cái)M南芥、煙草和番茄花粉管的極性生長的報(bào)道[3]。聶芳[4]已經(jīng)構(gòu)建了GEF7P-GUS轉(zhuǎn)基因植株，通過GUS組織化學(xué)染色法分析GEF7基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)GEF7基因主要在幼苗根的分生組織和維管組織、側(cè)根原基和根毛細(xì)胞表達(dá)，且經(jīng)生長素（NAA）誘導(dǎo)處理后，在上述細(xì)胞的表達(dá)顯著增強(qiáng)。因此，本研究對GEF7基因表達(dá)植株的幼苗根系發(fā)育情況進(jìn)行分析，同時(shí)對轉(zhuǎn)基因植株的表型也進(jìn)行了觀察分析，旨在為闡明GEF7基因功能的奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 GEF7基因過表達(dá)擬南芥植物種子來自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)理實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑及儀器 Trypton 和Yeast Extract 購自O(shè)XOID公司，卡那霉素（Kan）購自廣州康龍公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。熒光顯微鏡（BX51，OLYMPUS公司），光照培養(yǎng)箱（XT5408，杭州雪中炭公司），超凈工作臺（SW-CJ-1F，蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 GEF7基因過表達(dá)植株幼苗根系發(fā)育分析 利用已構(gòu)建的35S-GEF7 T1代陽性苗繼續(xù)繁殖至T3代，轉(zhuǎn)基因種子和野生型種子消毒后，在超凈臺內(nèi)用無菌水清洗數(shù)次，將種子傾倒于滅菌濾紙上，保持濾紙的濕潤。將種子播種至1/2平板上（添加50 mg/L卡那霉素），將種子排成一條線并保持一定間距（便于后面?zhèn)雀鶖?shù)目觀察），將平皿放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)，豎立培養(yǎng)3～9 d，在顯微鏡下觀察苗的主根長度，進(jìn)行拍照，運(yùn)用ImageJ軟件測量苗的主根長度。

1.2.2 GEF7基因過表達(dá)植株幼苗表型分析 篩選得到35S-GEF7 T1代陽性苗后，繼續(xù)篩選繁殖后代，以期得到純合子。期間觀察35S-GEF7植株T1、T2、T3代的幼苗的表型，以野生型（WT）為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 GEF7基因過表達(dá)植株幼苗根系發(fā)育分析

以GEF7基因過表達(dá)植株的各株系幼苗進(jìn)行根系發(fā)育分析試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GEF7基因過表達(dá)植株在幼苗期主根的長度明顯長于野生型對照（圖1A）。對過表達(dá)及野生型對照的3、7、9 d幼苗的主根長度在顯微鏡下進(jìn)行了定量分析，結(jié)果見圖1B。正常的野生型植株分生組織區(qū)域的細(xì)胞通常通過垂周分裂來加長細(xì)胞組成的縱向行列，可以進(jìn)一步在顯微鏡下對幼苗主根的分生組織進(jìn)行觀察，找出導(dǎo)致主根長短差異的原因。推測在過表達(dá)植株根分生組織區(qū)域可能分裂方式發(fā)生變化，也可能是分生組織細(xì)胞數(shù)目發(fā)生了變化。

2.2 GEF7基因過表達(dá)植株子葉和幼苗發(fā)育分析

野生型擬南芥幼苗的子葉通常是兩片，并且大小對稱（圖2A），表型微弱的35S-GEF7幼苗常出現(xiàn)各種異常形狀的子葉，如兩片子葉大小不對稱（圖2D）、子葉鉆石型（圖2F）等；表型嚴(yán)重的35S-GEF7幼苗會出現(xiàn)一片子葉（圖2E）、三片子葉（圖2B）甚至子葉融合（圖2C）等現(xiàn)象（這些表型35S-GEF1植株也都有，GEF1和GEF7都是Rac/ROP GEFs基因家族中的成員）。

野生型擬南芥幼苗的兩片子葉對稱打開，兩葉柄之間形成一個較大的角度（圖3苗1、6）。35S-GEF7幼苗的表型有：下胚軸膨大（類似于乙烯的效應(yīng)）（圖3中苗2～5）；兩葉柄很寬，且夾角很?。▓D3苗2）；子葉發(fā)育缺陷，如子葉肥厚、不能伸展（圖3苗5），或一片子葉發(fā)育不全（圖3苗3、4）；無根或根很短的苗較少（圖3苗7、8）等。

GEF是小G蛋白Rac/Rop的上游活化因子，GEF7基因過表達(dá)的幼苗表型與ROP組成型活化態(tài)的表型一致，暗示著GEF7可能在小G蛋白ROP調(diào)控器官的發(fā)育中起作用。

3 結(jié)論與討論

3.1 GEF7與生長素信號途徑

GEF的直接靶蛋白是Rac/Rop GTP酶，它能夠催化Rac/Rop由GDP結(jié)合的非活化態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP結(jié)合的活化態(tài)，活化的小G蛋白可以和下游的各種效應(yīng)分子相互作用，進(jìn)而執(zhí)行不同的細(xì)胞生理功能。Tao等[5]、Himanen等[6]闡明了ROP GTPase參與生長素信號途徑的新機(jī)制，位于細(xì)胞膜的ROPGTPase其活性受生長素調(diào)節(jié)，其被生長素活化后，通過Aux/IAAs選擇性降解，從而介導(dǎo)生長素誘導(dǎo)基因的表達(dá)。有研究表明，擬南芥GEF12在調(diào)節(jié)花粉管生長的過程中與上游受體激酶AtPRK2a作用并將信號傳遞給下游的ROP GTPase[7]。當(dāng)GEF7基因過表達(dá)時(shí)，幼苗主根顯著增長，表明Rac/Rop GEF7可能參與生長素介導(dǎo)的根發(fā)育的信號途徑，這需要進(jìn)一步的試驗(yàn)來證明，如對35S-GEF7轉(zhuǎn)基因植株的根進(jìn)行激素敏感性試驗(yàn)等。

3.2 GEF7與植物器官發(fā)育

植物中ROP GTPase作為一種分子開關(guān)調(diào)節(jié)各種各樣生理功能以及參與各種信號途徑，其中包括調(diào)節(jié)花粉管的生長、側(cè)根的發(fā)生，根毛的發(fā)育、過氧化氫的產(chǎn)生、細(xì)胞骨架的組裝以及參與生長素、脫落酸等植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[8-10]。GEF7基因過表達(dá)的植株子葉和幼苗表型呈現(xiàn)出各種異常形態(tài)，其中含有類似乙烯效應(yīng)的表型，推測GEF7可能在小G蛋白ROP調(diào)控器官的發(fā)育中起作用。

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