馬淑玲 孫新城 王富 張玲麗 張浩

摘要：采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定分離自實(shí)驗(yàn)室的一株細(xì)菌對(duì)黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）的抑菌效果。結(jié)果表明，這株細(xì)菌對(duì)以上3種病原菌均有較好的抑制效果，其中對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制效果最好；細(xì)菌粗發(fā)酵液經(jīng)一定強(qiáng)度的溫度和酸堿處理后仍有一定的抑菌效果，抑菌效果在pH 5.1～9.0之間無(wú)顯著差異；用胰蛋白酶處理后拮抗活性無(wú)明顯變化；經(jīng)硫酸銨處理過(guò)的粗發(fā)酵液，其上清液與沉淀均具有抑菌活性。

關(guān)鍵詞：粗發(fā)酵液； 黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）； 辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）；黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）； 抑菌活性

中圖分類號(hào)：S436.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）10-2377-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.018

植物病害每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的損害，化學(xué)農(nóng)藥的使用雖可有效地防治各種病害，但是大量連續(xù)使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)引起嚴(yán)重的環(huán)境污染和食品安全問(wèn)題，進(jìn)而為害人類的健康和生存質(zhì)量[1]。同時(shí)迫于農(nóng)業(yè)無(wú)公害、綠色、有機(jī)生產(chǎn)的迫切需要以及農(nóng)產(chǎn)品出口農(nóng)藥殘留等方面的限制要求，使研究和開發(fā)環(huán)境友好的生物農(nóng)藥進(jìn)行生物防治成為目前世界農(nóng)藥發(fā)展的趨勢(shì)[2]。植物病害生物防治的防治因子包括微生物、抗生素等多種因素。具有生防潛力的微生物有細(xì)菌、真菌、放線菌和病毒等種類。這些微生物可通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、分泌抗菌物質(zhì)、寄生病原菌等多種生防機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)植物病害的防治[3]?；颐共∈寝r(nóng)作物的主要病害之一，如何高效安全地進(jìn)行灰霉病的防治是長(zhǎng)期以來(lái)有待解決的難題。篩選對(duì)灰霉病菌有拮抗作用的微生物，從中開發(fā)出新型、高效、無(wú)毒天然農(nóng)用殺菌劑是防治灰霉病的重要途徑。安瑞平[4]采用組織分離法，從黃瓜各器官（根、莖、葉）中得到內(nèi)生細(xì)菌173株。通過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)篩選出8株對(duì)黃瓜灰霉病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的細(xì)菌，再對(duì)這8株菌發(fā)酵濾液的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，選出抑菌效果最好的2個(gè)菌株B12和B13，抑制率分別為84.0%和81.8%[4]。張興鋒等[5]分離了紅樹植物（木欖）體內(nèi)的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）CⅢ-1菌株，對(duì)多種病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，該菌產(chǎn)生的抗菌蛋白液對(duì)疫霉菌等植物病原菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該抗菌蛋白對(duì)熱不穩(wěn)定。

本研究針對(duì)目前對(duì)黃瓜灰霉病、辣椒疫霉病、黃瓜枯萎病尚無(wú)高效生防菌株的問(wèn)題，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定細(xì)菌MSL2#對(duì)以上3種病原菌是否具有生防效果。同時(shí)研究了經(jīng)不同溫度和酸堿處理后，MSL2#菌發(fā)酵液對(duì)這三種蔬菜病原菌抑菌活性的變化，以期得到具有高效生防潛力的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf），細(xì)菌MSL2#（拮抗菌，待鑒定）均由鄭州輕工業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂15 g、葡萄糖20 g、去離子水1 000 mL。用于病原真菌的活化及培養(yǎng)。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、瓊脂2 g、去離子水1 000 mL。用于生防細(xì)菌的活化及培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌活化 用接種環(huán)從試管中挑取MSL2#，接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)3～4 d。

1.2.2 發(fā)酵液的制備 取在斜面中活化好的MSL2#，注入2 mL無(wú)菌水，配成菌懸液，搖勻后用移液器各移取1 mL接種至裝有150 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于37 ℃搖床培養(yǎng)3 d。

將發(fā)酵好的發(fā)酵液于高速冷凍離心機(jī)中12 000 r/min離心10 min，收集上清液于250 mL無(wú)菌三角瓶中，細(xì)菌過(guò)濾器對(duì)離心上清液進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液于250 mL無(wú)菌三角瓶中，即為粗發(fā)酵液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 對(duì)病原真菌拮抗效果的測(cè)定 MSL2#對(duì)黃瓜灰霉病、辣椒疫霉病、黃瓜枯萎病3種病原真菌拮抗效果的測(cè)定采用抑制菌生長(zhǎng)速率法，重復(fù)3次，用直徑為0.6 cm的打孔器在培養(yǎng)好的供試菌落邊緣切下菌餅，用接種環(huán)反接于培養(yǎng)皿內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)4～5 d，用十字交叉法測(cè)量菌落擴(kuò)展直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率[6]。

1.2.4 熱處理對(duì)粗發(fā)酵液活性成分的影響 取5支10 mL滅過(guò)菌的離心管，分別加入5 mL粗發(fā)酵液，然后將這5支離心管分別于40、50、60、80、100 ℃水浴鍋內(nèi)處理15 min，采用抑制菌絲生長(zhǎng)速率法以黃瓜灰霉病菌為指示菌進(jìn)行拮抗效果測(cè)定，每個(gè)溫度處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)3個(gè)未加粗發(fā)酵液的對(duì)照；28 ℃恒溫培養(yǎng)，2、3、4、5、6 d后測(cè)量菌落擴(kuò)展直徑，并計(jì)算抑制率[2]。

1.2.5 pH變化對(duì)拮抗菌粗發(fā)酵液拮抗活性的影響 取6支10 mL滅過(guò)菌的離心管，分別加入5 mL粗發(fā)酵液，用0.025 mol/LNa2CO3溶液和0.05 mol/L檸檬酸溶液分別將離心管中的粗發(fā)酵液調(diào)pH為9.0、7.0、6.1、5.1、4.4、3.8，處理24 h后，再調(diào)回發(fā)酵液最初pH。采用抑制菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行拮抗效果測(cè)定，每個(gè)pH處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)3個(gè)未加粗發(fā)酵液的對(duì)照；28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d后測(cè)量菌落擴(kuò)展直徑，并計(jì)算抑制率。

1.2.6 酶處理對(duì)粗發(fā)酵液活性的影響 取3支10 mL滅過(guò)菌的離心管，加入5 mL粗發(fā)酵液，分別稱取胰蛋白酶5、10、15 mg置于5 mL粗發(fā)酵液中，將上述離心管于37 ℃水浴1 h，以黃瓜灰霉病菌為指示菌進(jìn)行拮抗活性測(cè)定。

1.2.7 硫酸銨對(duì)發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的沉淀研究 用不同濃度的硫酸銨（0、0.5、1.0、2.0、4.0 mol/L）對(duì)MSL2#的粗發(fā)酵液進(jìn)行沉淀離心后分別收集上清液，測(cè)定處理后的上清液對(duì)黃瓜灰霉病菌的拮抗試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSL2#的粗發(fā)酵液對(duì)三種蔬菜病原菌的抑制效果

MSL2#對(duì)黃瓜灰霉病菌、辣椒疫病菌、黃瓜枯萎病菌均有一定的抑制效果（圖1），抑制率均隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而上升，第6天開始有下降的趨勢(shì)。其中，發(fā)酵液對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制率最高為80.4%，而對(duì)辣椒疫病病原菌、黃瓜枯萎病菌的最高抑制率分別為62.7%、52.3%。說(shuō)明這株MSL2#的發(fā)酵液對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制效果最好。

2.2 pH變化對(duì)活性成分的影響

不同酸堿處理后的細(xì)菌發(fā)酵液上清液對(duì)黃瓜灰霉病菌抑制效果見圖2，結(jié)果表明，pH 3.8～9.0處理后的發(fā)酵液隨著培養(yǎng)天數(shù)的增多，對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑菌效果也不斷增加，6 d后，抑菌率達(dá)到最高。pH 5.1～9.0范圍內(nèi)對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制效果沒(méi)有顯著性差異，可見這株拮抗細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性物質(zhì)可以耐受較寬的酸堿范圍。

2.3 熱處理對(duì)粗發(fā)酵液的影響

MSL2#的發(fā)酵液通過(guò)不同溫度和不同時(shí)間的處理，以黃瓜灰霉病菌來(lái)檢測(cè)熱處理后的發(fā)酵液的抑制效果（圖3），結(jié)果表明，不同溫度處理后發(fā)酵液的抑菌活性存在顯著性差異，經(jīng)過(guò)40、50、60 ℃處理15 min的發(fā)酵液對(duì)黃瓜灰霉病菌抑制率最高分別達(dá)50%、38%、18%，100 ℃處理15 min后抑制率降低至5%以下，綜上可知MSL2#的粗發(fā)酵液具有一定的耐熱性。

2.4 酶處理對(duì)活性成分的影響

由圖4可知，經(jīng)酶處理的MSL2#粗發(fā)酵液隨著胰蛋白酶濃度的增大，其對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制率變化不顯著，表明MSL2#的拮抗物質(zhì)能抵抗胰蛋白酶的降解。

2.5 硫酸銨對(duì)發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的沉淀結(jié)果

用不同濃度的硫酸銨對(duì)MSL2#的粗發(fā)酵液進(jìn)行處理，測(cè)定處理后的上清液對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制率，結(jié)果見圖5。由圖5可知，經(jīng)過(guò)不同終濃度的硫酸銨處理過(guò)的發(fā)酵液對(duì)黃瓜灰霉病菌均有一定的抑制效果，隨著硫酸銨終濃度的增加，抑菌率則逐漸減小，說(shuō)明上清液的活性成分主要是蛋白質(zhì)，同時(shí)也可能含有非蛋白組分。

3 小結(jié)與討論

有研究曾對(duì)蔬菜病害進(jìn)行過(guò)生防菌的篩選并有一定的抑菌效果，但是這些菌株存在一定的不足，如抗菌蛋白對(duì)熱不穩(wěn)定等[4，5，7]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，MSL2#的粗發(fā)酵液對(duì)黃瓜灰霉病病菌、辣椒疫病病原菌、黃瓜枯萎病菌均有一定的抑制效果，其中對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制效果最好，菌株的發(fā)酵液對(duì)熱和酸堿都比較穩(wěn)定， 抑菌活性物質(zhì)能抵抗一定濃度的胰蛋白酶，以上結(jié)果均說(shuō)明MSL2#具有較好的生防潛力。

本研究?jī)H是對(duì)菌株進(jìn)行了初步發(fā)酵，該菌對(duì)黃瓜灰霉病的抑菌效果可達(dá)80%，但對(duì)辣椒疫病病原菌和黃瓜枯萎病菌的抑制率分別為62.7%、52.3%。將來(lái)隨著發(fā)酵條件和發(fā)酵工藝的發(fā)展，代謝物質(zhì)的產(chǎn)量將會(huì)進(jìn)一步提高，抑菌活性也會(huì)進(jìn)一步提高，為該菌的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

同時(shí)硫酸銨沉淀后的發(fā)酵液上清液和沉淀均有一定的拮抗活性，說(shuō)明發(fā)酵液活性物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)，也有非蛋白組分，其粗發(fā)酵液中拮抗物質(zhì)的活性成分的分離提純以及具體性質(zhì)及大田防治效果等都將有待于進(jìn)一步的深入研究。

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