石 朗，顧媛媛，焦丁寧，蘇德龍，王英昕，董培良，陳大忠

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱150040;3.哈藥集團(tuán)中藥二廠，哈爾濱150078)

注射用雙黃連粉針由金銀花、黃芩、連翹三味中藥組成，經(jīng)提取、精制、噴霧干燥(或冷凍干燥)，無菌分裝制成，具有抗菌、抗病毒、消炎及增強(qiáng)免疫的作用，經(jīng)藥理學(xué)研究表明，它對(duì)流感病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒Ⅲ型等具有較廣譜的抗病毒作用.臨床上主要用于治療急性上呼吸道感染、急性支氣管炎、扁桃體炎、肺炎及小兒病毒性肺炎等[1].在實(shí)際生產(chǎn)中，為了提高制劑質(zhì)量，保證成品合格率，在生產(chǎn)注射用雙黃連粉針劑的各個(gè)環(huán)節(jié)中都有嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn).但雙黃連粉針劑中間體一直沒有準(zhǔn)確的判定標(biāo)準(zhǔn).為此，本試驗(yàn)通過建立雙黃連中間體的指紋圖譜，考察其與成品制劑是否存在相關(guān)性，建立中藥注射劑的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、產(chǎn)業(yè)化和國際化的科學(xué)技術(shù)平臺(tái)，為快速實(shí)現(xiàn)中藥制劑的現(xiàn)代化和國際化奠定堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ).

中藥及其復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，中藥指紋圖譜技術(shù)能標(biāo)示中藥材特征的共有峰圖譜，借以辨別真?zhèn)?、評(píng)價(jià)原料藥材、半成品及成品質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性[2].UPLC相對(duì)于HPLC色譜法具有更好的分離效率，峰容量及靈敏度，能大大縮短樣品運(yùn)行時(shí)間[3]，本實(shí)驗(yàn)前期建立了雙黃連粉針的UPLC指紋圖譜方法，為了考察雙黃連粉針劑成品和中間體的相關(guān)性，本試驗(yàn)同樣采用UPLC技術(shù)建立中間體的指紋圖譜，為高效控制和科學(xué)評(píng)價(jià)雙黃連粉針劑的質(zhì)量提供了有力的數(shù)據(jù)支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

美國Waters AqcuityTM UPLC液相色譜儀(四元梯度泵一在線真空脫氣機(jī)一自動(dòng)進(jìn)樣器一二極管陣列檢測(cè)器一柱溫箱);MassLynx V4.1工作站;美國Micromass Q－TOF microTM四極桿－飛行時(shí)間質(zhì)譜)(電噴霧離子源－正、負(fù)離子掃描方法－Lockspray);JA2003精密電子天平(上海良平儀器廠生產(chǎn));KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)).

1.2 試藥與樣品

對(duì)照品均購自中國藥品生物制品檢定所，連翹苷對(duì)照品(批號(hào)110821－201213，供含量測(cè)定用)，黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)110715－201314，供含量測(cè)定用)，綠原酸對(duì)照品(批號(hào)110753－201314，供含量測(cè)定用)，雙黃連粉針劑中間體由哈爾濱中藥二廠生產(chǎn)和提供，批號(hào)為 1409405、1409406、1409407、1409408、1409409、1409410、1409411、1409413、1409414、1409416、1409417、1409418 和 1409419.乙腈為色譜純(美國Fisher公司生產(chǎn))，甲酸為色譜級(jí)(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))，水為屈臣氏蒸餾水.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLCTM BEH C18Column色譜柱(1.7 μm，2.1 × 50 mm，Waters Corp，Milford USA);流動(dòng)相:乙腈－0.1%的甲酸水，梯度洗脫條件如表1所示，流速:0.3 mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:3 μL.

表1 梯度洗脫表

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源(ESI)，采用正離子掃描檢測(cè);干燥氣溫度:350℃;碰撞能:100 V;干燥器流速:11 L/min;毛細(xì)管電壓:4 kV;霧化器壓力276 kPa;掃描方式全掃描，質(zhì)量掃描范圍:m/z100～1500.

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別取黃芩苷、連翹苷、綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶液分別制成每1 mL含黃芩苷0.1 mg、連翹苷60 μg、綠原酸40 μg 的混合對(duì)照品溶液.

2.4 供試品溶液的制備

從每批次樣品中隨機(jī)取本品5支的內(nèi)容物，混勻，取本品1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇溶液15 mL，超聲處理10 min，并稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜即得.

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 運(yùn)行時(shí)間

參照雙黃連粉針劑的運(yùn)行時(shí)間，故該中間體在與雙黃連粉針劑相同的色譜條件下采集時(shí)間確定為22 min.

2.5.2 精密度試驗(yàn)

取批號(hào)為1409405的雙黃連粉針劑中間體樣品，按2.4項(xiàng)下的方法制成6份供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)特征指紋圖譜，記錄色譜圖，各共有色譜峰對(duì)參比峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于3.0%，結(jié)果表明所用儀器精密度良好[4].

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為1409405的雙黃連粉針劑中間體樣品，按2.4項(xiàng)下的方法制成6份供試品溶液，照上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖.各共有色譜峰對(duì)參比峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于3.0%，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好.

2.5.4 樣品穩(wěn)定性考察

取供試品，分別于 0、2、4、6、8、12、24 h 測(cè)定，檢測(cè)特征指紋圖譜，記錄.各共有色譜峰對(duì)參比峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于3.0%，結(jié)果表明該樣品24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性.

2.6 樣品測(cè)定

將13批雙黃連粉針劑中間體樣品，照2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件依次進(jìn)樣3 μL檢測(cè)，記錄對(duì)照品溶液和供試品溶液UPLC色譜圖，分別見圖1、2.將雙黃連粉針劑批號(hào)1409405同樣制成供試品溶液，進(jìn)樣3 μL，記錄UPLC色譜圖，見圖3.

圖1 對(duì)照品溶液的UPLC色譜圖

圖2 雙黃連中間體指紋圖譜標(biāo)號(hào)圖

圖3 雙黃連粉針指紋圖譜標(biāo)號(hào)圖

2.7 指紋圖譜共有模式的建立與評(píng)價(jià)

2.7.1 共有峰的確定

通過對(duì)13批樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析，20 min 內(nèi)有26 個(gè)共有峰，分別為 1、3、4、8、12、13、14、17、18、20、21、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37、39、40、42 號(hào)色譜峰，各共有峰的相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間均具有較好的重復(fù)性，其RSD均小于0.5%.通過與對(duì)照品的色譜圖進(jìn)行比對(duì)，確定了三個(gè)特征峰，4號(hào)峰為綠原酸，29號(hào)峰為黃芩苷，31號(hào)峰為連翹苷.

2.7.2 參比峰的選擇

在各批次樣品圖譜中綠原酸的色譜峰(4號(hào)峰)分離度良好，峰面積積分值適中，且為所有樣品共有，所以確定綠原酸為參照色譜峰.

2.7.3 相似度評(píng)價(jià)

將13批雙黃連粉針中間體的圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004年A版相似度軟件，進(jìn)行相似度的評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2.結(jié)果表明，13批中間體樣品相似度均大于0.9，說明其相似度較好，工藝比較穩(wěn)定.

表2 13批注射用雙黃連(凍干)指紋圖譜的相似度

2.8 相關(guān)性測(cè)定結(jié)果

從測(cè)定結(jié)果可以看出，中間體的色譜圖中共有42個(gè)色譜峰，而粉針劑成品中僅有30個(gè)色譜峰，但所指認(rèn)的特征峰均可在雙黃連中間體和粉針劑成品色譜圖中追蹤得到，中間體、成品制劑中4號(hào)峰均為綠原酸，中間體中29號(hào)峰與粉針成品中的22號(hào)峰均為黃芩苷，中間體中31號(hào)峰與粉針成品中的24號(hào)峰均為連翹苷，由此可見，雙黃連中間體和粉針劑成品具有良好的相關(guān)性.

3 討論

本研究通過建立13個(gè)批次雙黃連凍干粉中間體的UPLC指紋圖譜，對(duì)其中多個(gè)組分進(jìn)行了研究，不限定域值，共有42個(gè)色譜峰.測(cè)定結(jié)果顯示，整體分離效果較好，同時(shí)根據(jù)對(duì)照品對(duì)3個(gè)特征色譜峰的歸屬進(jìn)行了定性分析，13批中間體的供試色譜圖中有26個(gè)共有峰，相似度大于0.9，說明各批次間工藝較穩(wěn)定，具有良好的一致性，該方法可以用于雙黃連粉針中間體的質(zhì)量控制.

將同一批次的雙黃連粉針中間體與其成品制劑的色譜譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)成品制劑的色譜峰數(shù)目減少了(中間體42個(gè)色譜峰，成品30個(gè)色譜峰)，所指認(rèn)的三個(gè)特征峰在雙黃連中間體和粉針劑成品色譜圖中追蹤得到，可用于其質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)說明中間體和成品制劑之間具有相關(guān)性.對(duì)于減少的化學(xué)成分是否有效，后期有待于繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)確認(rèn)和藥效進(jìn)行深入研究.本研究在前期建立了相同批次雙黃連粉針的指紋圖譜，其相似度水平略低于中間體的相似度，其原因是否在于工藝上的問題，有待于進(jìn)一步研究與探討，總之，該方法的建立對(duì)成品制劑的質(zhì)控奠定了基礎(chǔ)，且為中藥注射劑的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)業(yè)化和國際化提供了科學(xué)的技術(shù)平臺(tái)[5].

[1]李 方，姜文紅，劉麗娟，等.注射用雙黃連(凍干)指紋圖譜的建立及其在質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].中成藥，2007，29(8):1196－1198.

[2]譚超元，王海波，王 東.鉤藤飲片HPLC指紋圖譜研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(1):63.

[3]ZHOU D，ZHANG X，XU Q，et al.UPLC/Q－TOFMS/MS as a powerful technique for rapid identification of polymethoxylated flavones in Fructus aurantii[J].J Pharm Biomed Anal，2009，50(1):2－8.

[4]CHEN W K，LUO Y H，XIONG W.Sutdy on fingerprint chromatogram of Coyrdalis decumbens for injection[J].Chin J Pharm Anal，2008，28(3):434.

[5]國家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)[J].中成藥，2000，22(10):671－ 675.