郭晶晶 俞麗云 黃 美 梁榮喜 陳 舜 何以敉 薛恩生福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和臨床學(xué)院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院超聲科，福建省超聲醫(yī)學(xué)研究所（福州 350001）

持續(xù)低流量復(fù)灌注對(duì)兔睪丸不全扭轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡的影響

郭晶晶 俞麗云 黃 美 梁榮喜 陳 舜 何以敉 薛恩生*
福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和臨床學(xué)院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院超聲科，福建省超聲醫(yī)學(xué)研究所（福州 350001）

摘要目的 研究持續(xù)性低流量復(fù)灌注對(duì)睪丸不全扭轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。方法 實(shí)驗(yàn)分為輕度睪丸缺血組（A組）和中度睪丸缺血組（B組），兩組各分為對(duì)照組（分別為AS組和BS組）和后處理組（A1和B1為45s維持組，A2和B2為45s漸增組，A3和B3為30s維持組，A4和B4為30s漸增組）。對(duì)照組進(jìn)行直接復(fù)灌注，A1、B1組及A3、B3組分別進(jìn)行45s和30s的維持相同的低流量復(fù)灌注，A2、B2組及A4、B4組分別進(jìn)行45s和30s的漸增加的低流量復(fù)灌注。缺血前與術(shù)后3d進(jìn)行睪丸超聲造影，并檢測(cè)睪丸組織Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱門蛋白酶-3 （caspase-3）、凋亡指數(shù)（AI）。結(jié)果 術(shù)后3d超聲造影與缺血前比較，A4組及B4組的始增時(shí)間（AT）、達(dá)峰時(shí)間（TTP）、峰值強(qiáng)度（PI）、峰值基礎(chǔ)強(qiáng)度差（PBD）差異比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；峰值減半時(shí)間（DT/2）縮短，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。45s漸增組和30s組的AI明顯低于對(duì)照組和45s維持組（P＜0.01）。30s組Bax和caspase-3均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)論 持續(xù)低流量復(fù)灌注對(duì)兔輕、中度睪丸不全扭轉(zhuǎn)具有不同程度的保護(hù)作用，保護(hù)效果與復(fù)灌持續(xù)時(shí)間和血流增幅有關(guān)，以30s漸增低流量復(fù)灌保護(hù)作用最顯著。

關(guān)鍵詞再灌注; 精索扭轉(zhuǎn); 細(xì)胞凋亡

睪丸扭轉(zhuǎn)是泌尿外科常見的陰囊急癥，可引起睪丸組織缺血缺氧并造成生精細(xì)胞凋亡，故應(yīng)當(dāng)盡早恢復(fù)血供以避免長(zhǎng)時(shí)間缺血造成組織壞死，而一次性完全恢復(fù)組織血供將引起缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury, IRI）。張國(guó)明等[1]證實(shí)漸進(jìn)后處理較間隔缺血后處理更能有效減輕鼠缺血心肌的IRI，但張國(guó)明的漸進(jìn)后處理有再次缺血環(huán)節(jié)，可能對(duì)組織造成“二次損傷”，本實(shí)驗(yàn)擬改良漸進(jìn)后處理模式為可控持續(xù)性低流量復(fù)灌注，通過觀察超聲造影、生精細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）和胱門蛋白酶-3 （caspase-3）等指標(biāo)，研究進(jìn)行持續(xù)性低流量復(fù)灌注能否對(duì)睪丸不全扭轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生保護(hù)作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

76只健康雄性大白兔，體質(zhì)量2.0～3.3kg，平均體質(zhì)量為（2.45±0.16）kg，兔齡17.1～22.6周[（19.7± 1.3）周]，許可證號(hào)：SCXR-2008-0002。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《福建省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例實(shí)施細(xì)則》執(zhí)行。

二、儀器與方法

（一）儀器與試劑

Acuson sequoia-512彩色多普勒超聲診斷儀，15L8W線陣變頻探頭，選擇小器官睪丸模式，灰階頻率8.0 MHz～14.0MHz，彩色頻率7.0 MHz ～14.0MHz，彩色血流量程調(diào)至0.9cm/s。Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件，Syngo US Workplace超聲造影分析軟件。SonoVue超聲造影劑（意大利Bracco公司），戊巴比妥鈉（上海源葉生物科技有限公司），兔抗兔Bax一抗（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗兔caspase-3一抗（北京百邁客生物技術(shù)有限公司），KGA7022原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物發(fā)展有限公司）等。

（二）動(dòng)物模型

3%戊巴比妥鈉溶液按1mL/kg對(duì)大白兔進(jìn)行耳緣靜脈麻醉并置留置針。隨機(jī)選擇一側(cè)睪丸，暴露精索結(jié)構(gòu)，在距睪丸上極約1cm處用蛙心管夾對(duì)精索進(jìn)行不全鉗夾，在彩色多普勒超聲監(jiān)測(cè)下，使睪丸內(nèi)彩色血流信號(hào)面積減少至鉗夾前的50%，制成睪丸血運(yùn)障礙模型，鉗夾后連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察。當(dāng)睪丸血流信號(hào)減少至鉗夾前的20%～30%時(shí)，輕度缺血模型建立成功。當(dāng)睪丸血流信號(hào)減少至鉗夾前的5%～10%時(shí)，中度缺血模型建立成功[2]。

（三）實(shí)驗(yàn)分組與方法

76只大白兔隨機(jī)分為輕度缺血組（A組，38只）和中度缺血組（B組，38只），依前述方法建立不同缺血程度的睪丸扭轉(zhuǎn)模型。A、B組各分為對(duì)照組（AS組和BS組，每組6只）和后處理組（A1和B1為45s維持組，A2和B2為45s漸增組，A3和B3為30s維持組，A4和B4為30s漸增組，每組8只）。成功建立模型后，對(duì)照組進(jìn)行直接復(fù)灌注（100%），后處理組通過旋轉(zhuǎn)蛙心管夾螺帽進(jìn)行不同低流量（25%、50%、75%）復(fù)灌注后處理，A1、B1組及A3、B3組各維持45s和30s的25%的血流灌注量后，再完全復(fù)灌注。A2、B2組及A4、B4組分別進(jìn)行45s和30s的逐漸增加血流量的灌注后，再完全復(fù)灌注，見圖1。術(shù)后各組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，3d后進(jìn)行超聲造影并取材檢驗(yàn)。

圖1 實(shí)驗(yàn)分組與低流量復(fù)灌注后處理方式示意圖

（四）標(biāo)本的檢測(cè)

術(shù)后3d取約300mg患側(cè)睪丸組織各2份液氮速凍保存，用Western blot法檢測(cè)Bax和caspase-3，剩余組織用10%中性福爾馬林緩沖溶液固定24h后行原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)計(jì)數(shù)AI。

（五）超聲造影

于缺血前、再灌注前及術(shù)后3d分別進(jìn)行雙側(cè)睪丸超聲造影檢查，設(shè)置造影頻率7 MHz，造影增益0dB，機(jī)械指數(shù)、熱力指數(shù)0.1，取雙側(cè)睪丸最大橫切面，以0.1mL/kg劑量從耳緣靜脈團(tuán)注超聲造影劑，對(duì)雙側(cè)睪丸造影圖像進(jìn)行錄影，動(dòng)態(tài)觀察睪丸內(nèi)造影劑充盈情況。造影錄像用Syngo US Workplace超聲造影分析軟件得出時(shí)間-強(qiáng)度曲線（time-intensity urve，TIC），并對(duì)比分析患側(cè)睪丸不同階段的超聲造影參數(shù)：始增時(shí)間（arrival time，AT）、達(dá)峰時(shí)間（time to peak，TTP）、峰值強(qiáng)度（intensity to eak，PI）、峰值基礎(chǔ)強(qiáng)度差（peak-base intensity ifference，PBD）、峰值減半時(shí)間（DT/2）。

三、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.5軟件行正態(tài)性檢驗(yàn)及Lenven方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析，如P＜0.05則再進(jìn)行多個(gè)均數(shù)間的多重比較（least significant difference，LSD檢驗(yàn)）。以雙側(cè)P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、雙側(cè)睪丸超聲造影

缺血前造影見造影劑向心性強(qiáng)化，各參數(shù)組間比較均無差異（P＞0.05）。再灌注前造影見AT、TTP、DT/2顯著延長(zhǎng)，PI、PBD明顯降低（P＜0.01），TIC呈“慢進(jìn)慢退”型，見圖2。術(shù)后3d與缺血前比較，A4組及B4組的AT、TTP、PI、PBD無差異（P＞0.05），DT/2縮短（P＜0.05），各組數(shù)據(jù)見圖3。

圖2 缺血前、再灌注前及術(shù)后3d3d雙側(cè)睪丸TICTIC

圖3 術(shù)后3d, A3d, A、B組各造影參數(shù)結(jié)果箱式圖

二、術(shù)后3d患側(cè)睪丸凋亡指數(shù)

A組中各后處理組AI均明顯低于AS組（P＜0.01），且A2、A3、A4組AI明顯低于A1組（P＜0.01）；B組中各后處理組AI較BS組均顯著降低（P＜0.01），且B2、B3、B4組AI明顯低于B1組（P＜0.01），其中以B4組最低，見圖4、表1。

圖4 術(shù)后33dd,, 患側(cè)睪丸生精細(xì)胞凋亡光鏡圖（×200）

表1 術(shù)后3d, 3d, 患側(cè)睪丸生精細(xì)胞凋亡指數(shù)(%%)

三、術(shù)后3d3d患側(cè)睪丸BaxBax和caspase-3ase-3蛋白相對(duì)含量

A、B組中3、4組的B a x均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；A、B組中各后處理組caspase-3均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），且3、4組低于1、2組（P＜0.05），見圖5、表2。

圖5 術(shù)后3d, 3d, 患側(cè)睪丸BaxBax和caspase-3ase-3蛋白印跡條帶

表2 術(shù)后3d, 3d, 患側(cè)睪丸BaxBax和caspase-3ase-3蛋白相對(duì)含量（x±sxs）

討 論

精索不全扭轉(zhuǎn)可造成睪丸血供部分受阻，導(dǎo)致睪丸實(shí)質(zhì)內(nèi)微循環(huán)障礙，超聲造影能夠反映其血流動(dòng)力學(xué)變化。Ak?ora等[3]發(fā)現(xiàn)漸處理能夠?qū)馆p、中度缺血睪丸組織的再灌注損傷，但低流量的漸處理對(duì)缺血睪丸組織血流動(dòng)力學(xué)的影響及原理并未得到闡明。麻日虎等[4]在研究漸處理對(duì)肺IRI的影響過程中發(fā)現(xiàn)，肺組織的IRI主要為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，直接復(fù)灌注可造成血管通透性和血管阻力增加。低流量的漸進(jìn)后處理可以通過低壓力的血流復(fù)灌，避免直接完全開放精索血供時(shí)，因灌注壓驟然升高造成的血管內(nèi)皮急劇擴(kuò)張、血管舒縮功能受損[5-7]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用超聲造影評(píng)價(jià)低流量后處理對(duì)缺血睪丸組織的保護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)30s漸增組的AT、TTP、PI、BD與缺血前比較無差異，表明血流增幅適中的低壓復(fù)灌注確能避免高壓復(fù)灌對(duì)血管內(nèi)皮的不良影響，降低血管通透性，減少液體外滲，減輕組織水腫對(duì)微血管的壓迫[6]，使微血管狀態(tài)最為接近缺血前正常情況，并暢通內(nèi)循環(huán)，使造影劑迅速廓清，縮短DT/2為組內(nèi)最低。

陳謙謙等[2]應(yīng)用間隔缺血后處理減輕睪丸IRI的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同復(fù)灌/停灌時(shí)間的缺血后處理保護(hù)效應(yīng)不同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和45s維持組相較，在復(fù)灌即刻給予30s低流量后處理和45s漸增低流量后處理，對(duì)生精小管結(jié)構(gòu)恢復(fù)更加有利，AI降低更為明顯，表明對(duì)睪丸IRI的保護(hù)作用不僅與后處理時(shí)間有關(guān)，而且與后處理方式也存在一定關(guān)系。

本組實(shí)驗(yàn)顯示無論在輕度缺血組還是中度缺血組中，30s組的促凋亡蛋白Bax和caspase-3均顯著低于對(duì)照組。正常狀態(tài)下細(xì)胞即存在凋亡現(xiàn)象，這種生理性的細(xì)胞凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡中，對(duì)組織更新等存在積極意義。當(dāng)組織缺血時(shí)，促凋亡蛋白被大量合成并釋放，使細(xì)胞凋亡失平衡。睪丸缺血后直接復(fù)灌注因完全開放血供、大幅增加組織供氧量，可引起氧自由基（reactive oxygen pecies，ROS）堆積、鈣超載、脂質(zhì)過氧化等一系列反應(yīng)[8-11]，促使大量促凋亡蛋白Bax釋放入胞漿插入線粒體膜內(nèi)引起細(xì)胞色素C（Cytochrome

，Cyt C）釋放[12-14]。Cyt C釋放并激活caspase-3等引起瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并最終加劇各級(jí)生精細(xì)胞凋亡。30s低流量后處理通過控制復(fù)灌注的血流量，持續(xù)性適量供應(yīng)氧化底物，緩和氧化應(yīng)激反應(yīng)，使產(chǎn)生的ROS始終維持在能夠被清除的范圍內(nèi)，減輕其對(duì)生精細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷，削弱再灌注過程中產(chǎn)生的ROS對(duì)各級(jí)精母細(xì)胞分裂增殖活動(dòng)的影響[15-17]，從源頭控制生精細(xì)胞凋亡的發(fā)生，降低睪丸組織促凋亡蛋白Bax和caspase-3的產(chǎn)生，保護(hù)精原細(xì)胞，保證產(chǎn)生精子的數(shù)量和質(zhì)量[18]。

另外，30s組產(chǎn)生的caspase-3低于45s組，說明除了通過低流量復(fù)灌注限制氧化底物的供應(yīng)來減少促凋亡蛋白產(chǎn)生外，在何時(shí)完成后處理，進(jìn)行完全復(fù)灌注對(duì)促凋亡蛋白產(chǎn)生同樣重要。有研究發(fā)現(xiàn)用ATP對(duì)兔缺血心肌進(jìn)行后處理，細(xì)胞凋亡率明顯減低[19, 20]，但具體作用途徑尚不明確。我們推測(cè)30s組較45s組更早完全開放復(fù)灌血流，氧等物質(zhì)供應(yīng)的適時(shí)增多，可能加強(qiáng)了生精細(xì)胞線粒體有氧呼吸，使ATP產(chǎn)量增加，降低了caspase-3的產(chǎn)生，從而減輕細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)證明持續(xù)低流量復(fù)灌注對(duì)兔輕、中度缺血睪丸細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用，低流量復(fù)灌注的方式和持續(xù)時(shí)間不同保護(hù)效果有所差異，將復(fù)灌持續(xù)時(shí)間結(jié)合血流量增幅可能尋找到低流量后處理的最佳模式，如本組中30s漸增低流量復(fù)灌注。但睪丸扭轉(zhuǎn)低流量復(fù)灌所需的具體灌注壓范圍、含氧量多少仍需進(jìn)一步研究，該方法是否優(yōu)于復(fù)灌/缺血間隔后處理對(duì)睪丸扭轉(zhuǎn)的保護(hù)作用也需進(jìn)一步探討。

參 考 文 獻(xiàn)

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（2014-07-30收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.01.005

中圖分類號(hào)R 697.24

*通訊作者, E-mail: xuees31@126.com

Effects of lasted low fl ow reperfusion postconditioning to incomplete testicular torsion in rabbit

Guo Jingjing, Yu Liyun, Huang Mei, Liang Rongxi, Chen Shun, He Yimi, Xue Ensheng*
Clinical Academy, Union Hospital of Fujian Medical University/Department of Ultrasound, Union Hospital of Fujian Medical University/Fujian Provincial Institute of Ultrasonic Medicine, Fuzhou 350001, China
Corresponding author: Xue Ensheng, E-mail: xuees31@126.com

AbstractObjective Explore the protective effects of lasted low fl ow reperfusion postconditioning to incomplete testicular torsion apoptosis. Methodsthods The experiment was randomly divided into mild ischemia group(A) and moderate ischemia group (B), and each group was divided into control groups (AS, BS) and postconditioning groups (A1, A2, A3, A4 and B1、B2、B3、B4). The control groups got reperfusion completely and immediately, groups A1, B1 and groups A3, B3 got same lasted low flow reperfusion with 45s and 30s, groups A2, B2 and groups A4, B4 got lasted gradually increasing low fl ow reperfusion with 45s and 30s. Got CEUS appearances before ischemia and postoperation, and analyzed the Bax, caspase-3 and AI of the affected testicle. Resultssults Compared the postoperative parameters with preoperation, the AT, TTP, PI, PBD of the groups A4 and B4 had no change (P＞0.05), the DT/2 were shorten(P＜0.05). The AI of groups 2, 3, 4 were signifi cantly lower than control group and group 1(P＜0.01). The Bax and caspase-3 of postconditioning groups with30s were signifi cantly lower than control groups (P＜0.01). Conclusionusion The lasted low fl ow reperfusion postconditioning has different protective effects to mild and moderate incomplete testicular torsion in rabbit, and the effect relates to the lasted time of reperfusion and the bloodfl ow growth, while the effect of lasted gradually increasing low fl ow reperfusion postconditioning with 30s is the most signifi cant.

Key wordsords reperfusion; Spermatic Cord torsion; apoptosis