常向彩,韋國陸，馬 明,張聲俊,施渺筱,楊曉農(nóng)

(1.安順學院農(nóng)學院,貴州安順 561000;2.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院,四川成都 610041;3.安順學院資源與環(huán)境工程學院,貴州安順 561000)

蝦仁中酸性紅73間接ELISA檢測方法的建立

常向彩1,2,韋國陸1，+，馬 明1,張聲俊3,施渺筱1,楊曉農(nóng)2,*

(1.安順學院農(nóng)學院,貴州安順 561000;2.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院,四川成都 610041;3.安順學院資源與環(huán)境工程學院,貴州安順 561000)

本文采用活性酯法和N,N-羰基二咪唑法分別合成了酸性紅73的人工抗原,方陣滴定實驗表明活性酯法所得兔抗酸性紅73的IgG更適合用于后繼實驗,以此為基礎(chǔ)建立了一種蝦仁中酸性紅73的間接ELISA檢測方法并對反應(yīng)條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后,該方法的半數(shù)抑制濃度(IC50)為45.39 μg/L,檢測限(LOD)為5.64 μg/L。交叉反應(yīng)實驗結(jié)果表明除蘇丹紅3號(0.15%)外與番紅花紅、苯酚紅、剛果紅、堿性品紅和胭脂紅等其他競爭物無交叉反應(yīng)。在蝦仁中的空白添加回收率范圍為71.3% ～ 84.4%,變異系數(shù)(RSD)<9.55%。此法可用于蝦仁中酸性紅73的殘留檢測,并為進一步制備單克隆抗體和研制快速檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

蝦仁,酸性紅73,活性酯法,N,N-羰基二咪唑法,ELISA

酸性紅73(Acid red 73,AR73)俗稱酸性大紅GR,相對分子質(zhì)量為556.48,有中等毒性,強致癌性,遺傳毒性[1-3]。在印染業(yè)中屬禁用“致癌染料”。 有研究表明AR73能以很高的親和力與人血清白蛋白(HAS)結(jié)合從而影響其正常的生理功能[4-5]。因此,世界很多國家已明令禁止在食品中添加,但由于AR73有較強的著色能力,一些食品加工企業(yè)仍將其非法作為蝦、肉等食品著色劑使用。

目前國內(nèi)外關(guān)于蝦仁中AR73檢測方法的文獻報道較少,2008年,寧尚勇等運用反相液相色譜法建立了測定蝦仁中合成色素(酸性大紅GR、金黃粉、橙黃G、酸性紅1號、酸性紅26)的方法,此方法對酸性大紅GR的LOD為0.04 μg/g,相關(guān)系數(shù)大于0.9998[6]。2012年,有文獻報道,采用N-羥基琥珀亞胺活性酯法將酸性紅73分別與牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)合成了免疫原和包被原,獲得的抗血清可以實現(xiàn)對酸性紅73的檢測,此方法的IC50為181.15 μg/L,LOD為7.93 μg/L,空白添加回收率范圍為63.5%～90.7%,RSD<6.76%,但該方法未進行ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化和實際樣品的檢測[7]。液相色譜等儀器檢測方法具有假陽性率低、精確度高等優(yōu)點,但是檢測過程繁瑣,耗時,成本高,設(shè)備昂貴且操作難度大,只適用于實驗室檢測和單樣本檢測。ELISA檢測方法以操作簡便、方法靈敏、高效、快速、適用范圍廣等優(yōu)點在最近幾年得到了快速發(fā)展,通常用于藥物殘留檢測時的快速篩選[8]。

本實驗主要分析了活性酯法和N,N-羰基二咪唑(CDI)法所合成AR73人工抗原的免疫原性,同時對蝦仁中檢測AR73間接ELISA方法的反應(yīng)條件進行了優(yōu)化,進一步豐富了ELISA檢測方法的實際應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸性紅73標準品 日本TCI公司,GR;牛血清白蛋白BSA 北京J&K公司;卵清白蛋白(OVA)、弗氏佐劑、TMB 美國Sigma公司;預(yù)染蛋白Marker 美國Thermo科技公司;N,N-羥基琥珀亞胺(NHS)、N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、吡啶 成都艾德化工有限公司;N,N-羰基二咪唑(CDI)等其他試劑購自成都科龍化工試劑廠;除酸性紅73外其他試劑均為AR。

溶液系統(tǒng):CBS:0.05 mol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液;PBS:0.01 mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液;Tris-HCl:0.05 mol/L pH7.2的Tris-HCl緩沖液;PBST:含有0.05%吐溫-20的PBS緩沖液;0.1%明膠-PBST:含有1%明膠的PBST溶液;TMB-乙醇:含有1% TMB的乙醇溶液與底物緩沖液混合后加入0.75%的過氧化氫溶液32 μL所得;TMB-DMSO:含有1% TMB的DMSO溶液與底物緩沖液混合后加入0.75%的過氧化氫溶液32 μL所得;以上溶液按文獻報道的方法配制[9]。

健康新西蘭白兔6只(均為雌性,7～8月齡,體重約為3.5 kg),購自四川大學華西醫(yī)院實驗動物中心。

通用型電泳儀164-5070及凝膠成像系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司;Centrifuge 5804R臺式高速大容量冷凍離心機 德國Eppendorf公司;DU-800紫外/可見光分光光度計 美國Beckman Coulter公司;超純水儀Milli-Q 美國Millipore公司;90-2型恒溫磁力攪拌器 上海青浦滬西儀器廠;透析袋(截留分子量8000～14000)及專用夾 上海生工生物公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學儀器有限公司;96孔可拆酶標板 美國Costar公司;Model 680型酶標儀 美國BIO-RAD公司;E-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 人工抗原的合成與鑒定 參照活性酯法[7]和N,N-羰基二咪唑法[10]將AR73分別與牛血清白蛋白偶聯(lián),合成酸性紅73-半琥珀酸酯-牛血清白蛋白(AR73-HS-BSA)和酸性紅73-牛血清白蛋白(AR73-BSA),用作免疫原。以同種方法將BSA換成OVA,合成酸性紅73-半琥珀酸酯-卵清蛋白(AR73-HS-OVA)和酸性紅73-卵清蛋白(AR73-OVA),用作包被原。所得人工抗原用生理鹽水在4 ℃環(huán)境下攪拌透析5 d,換液10次后,采用紫外掃描法和SDS-PAGE法對其進行鑒定,人工抗原結(jié)構(gòu)式如圖1所示(Protein為BSA或OVA)。人工抗原的偶聯(lián)比(Ca/Cb)按以下公式計算:Ca/Cb=(A偶274×KBSA280-A偶280×KBSA274)/(A偶280×KAR73 274-A偶274×KAR73280)。

圖1 AR73人工抗原的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of Artificial antigen

1.2.2 多克隆抗體的制備與純化 6只健康成年新西蘭大白兔(編號R1～R6),采用注射器法將免疫原與等量弗氏佐劑乳化后,按1 mg/只的量進行皮下多點注射,免疫間隔周期為2周,共免疫7次。AR73-HS-BSA免疫R1～R2,AR73-BSA免疫R3～R4,R5和R6分別作為各組的免疫對照,抗體血清以辛酸-飽和硫酸銨法提取IgG,-20 ℃分裝凍存[11]。

1.2.3 間接ELISA方法反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化 將兩種包被原與來自免疫原的抗體R1和R2分成四種組合,采用方陣滴定法評價ELISA的檢測能力,以P/N≥2.1,即OD450 nm大于2倍陰性對照孔的血清最高稀釋倍數(shù)作為血清的ELISA效價,同時選擇OD值在1.3左右的抗原濃度和血清稀釋度為最適工作濃度。利用包被原和抗體的最佳組合,按文獻報道操作進行ELISA方法的建立[12],將無競爭物時的OD值作為B0值,各濃度競爭物抑制時的OD值作為B值,以B/B0(結(jié)合率)為縱坐標,以各競爭物濃度的對數(shù)(lgC)為橫坐標,繪制競爭抑制曲線。將產(chǎn)生50%和20%抑制時的競爭物濃度定義為本方法對該競爭物的IC50和LOD。以此為基礎(chǔ),分別對包被液及包被方式、封閉液、抗體稀釋液及溫育時間、底物及反應(yīng)時間等ELISA反應(yīng)體系進行優(yōu)化(優(yōu)化程序見表1),分析不同條件下的IC50、最大吸光值(Amax)以及Amax/IC50等反應(yīng)參數(shù),選擇Amax/IC50最大值所對應(yīng)的條件為最佳反應(yīng)體系,重新建立AR73的競爭抑制曲線。

表1 ELISA方法的優(yōu)化程序

1.2.4 方法的特異性檢測 將AR73標準品溶液依次換成系列濃度的蘇丹紅3號、番紅花紅、苯酚紅、剛果紅、堿性品紅和胭脂紅等另外6種競爭物,計算IC50和交叉反應(yīng)率(CR),評價ELISA方法的特異性。CR按AR73的IC50與競爭物IC50的百分比計算。

1.2.5 方法準確度的評價 稱6 g空白蝦仁,剪碎后平均分成3組,按10 ng/g,30 ng/g和50 ng/g添加AR73,加樣品提取液(乙醇∶氨水∶水=7∶2∶1)5 mL,超聲萃取20 min,8000 r/min離心10 min,取上清旋轉(zhuǎn)蒸干,殘留物以2 mL PBS復溶進行空白樣品的標準添加回收實驗,進行空白樣品的標準添加回收實驗,評價所建立方法的準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定

AR73屬于半抗原,必須將其合成人工抗原后方可產(chǎn)生抗體。Goodrow等[13]提出對于人工抗原的合成應(yīng)該掌握以下原則:載體蛋白偶聯(lián)的半抗原分子應(yīng)與待檢測分子具有相似的立體構(gòu)象、形狀及電子分布;偶聯(lián)物的“間隔臂”不宜過長,注意避免“臂抗體”的產(chǎn)生;半抗原分子含有的活性基團與載體蛋白偶聯(lián)后,對待測分子不造成影響;偶聯(lián)物應(yīng)具有與待測分子相同的基本結(jié)構(gòu)。基于以上幾點原則,本實驗首先對AR73結(jié)構(gòu)上的羥基進行修飾,引進一個帶有羧基的活性基團,得到酸性紅73的衍生物,以改進的活性酯法與載體蛋白偶聯(lián),合成了兩種具有較長“間隔臂”的人工抗原;采用改進的N,N-羰基二咪唑法,將AR73分子上的羥基直接與載體蛋白偶聯(lián),合成了另外兩種較短“間隔臂”的人工抗原。所得四種人工抗原經(jīng)透析純化后,半抗原的紅色始終存在且全波長紫外掃描圖譜顯示(圖2),偶聯(lián)物兼具載體蛋白(276 nm)和AR73(514 nm)的相似特征峰,因此可初步判定半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。AR73-HS-BSA、AR73-HS-OVA、AR73-BSA、AR73-OVA的偶聯(lián)比分別為12∶1、13∶1、9∶1、5∶1。SDS-PAGE結(jié)果顯示偶聯(lián)物的條帶比較粗且滯后于載體蛋白(圖3),由此可以大致判定本方法具有較好的偶聯(lián)效果。

圖2 AR73,OVA,AR73-OVA的紫外掃描圖Fig.2 The UV-scanning of AR73,OVA and AR73-OVA

圖3 蛋白載體與偶聯(lián)物的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.3 SDS polyacrylamide gel electrophoresis map forprotein carrier and conjugates注：1.BSA;2.AR73-HS-BSA;3.AR73-BSA;4.OVA;5.AR73-HS-OVA;6.AR73-OVA。

2.2 最佳組合與最適工作濃度的確定

在以往文獻報道中[14-17],異源包被模式被證實可以用于優(yōu)化ELISA方法。為優(yōu)化ELISA方法,將兩種包被抗原和來自兩種免疫抗原的抗體分入4種組合評價檢測能力。方陣滴定實驗顯示(結(jié)果見表2),在兩組免疫動物中,抗體R1和抗體R3在各組中的血清效價最高,但IC50結(jié)果表明抗體R1優(yōu)于抗體R3,即采用活性酯法合成的包被原和免疫原所得抗體(組合1)優(yōu)于CDI法等其他組合,因此,選擇1號兔子的抗體用于后繼實驗。造成實驗中組合1優(yōu)于其他組合的原因之一,可能是CDI法合成的人工抗原偶聯(lián)比較低,Schneider等[18]認為最合適的偶聯(lián)比為10～20,本實驗中CDI法合成的免疫原和包被原的偶聯(lián)比僅為9和5,但也有其他實驗表明[19],誘導抗體產(chǎn)生的決定性因素并非是偶聯(lián)比,偶聯(lián)比為1時也可以獲得高親和力的抗體,只是免疫應(yīng)答較慢;另外一個原因可能是CDI法所得的人工抗原間隔臂過短,Frieia[20]認為擁有3～6個碳原子直鏈的間隔臂最佳,間隔臂過短,載體蛋白的空間位阻則會影響動物免疫系統(tǒng),難以識別半抗原的特征結(jié)構(gòu),而且蛋白載體的局部化學環(huán)境會造成半抗原的立體結(jié)構(gòu)的改變,CDI法所得偶聯(lián)物為只有一個碳原子間隔臂的人工抗原,或許導致AR73特征結(jié)構(gòu)暴露不完全,從而難以誘導機體產(chǎn)生特異性更強的抗體。

表 2 ELISA方法中四種組合的稀釋度

表3 ELISA反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

2.3 間接ELISA方法的優(yōu)化結(jié)果

通過ELISA反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果可知(表3),在37 ℃溫度下采用CBS包被2 h、1%明膠封閉30 min、含有0.1%明膠的PBST溶液稀釋抗體溫育60 min并以TMB-DMSO為底物反應(yīng)15 min時,Amax/IC50的值最大,可作為該方法的最佳反應(yīng)條件。重新建立AR73的競爭抑制曲線(圖4),結(jié)合率與lgC之間的線性方程為Y=-33.122X+104.89,R2=9714。經(jīng)計算IC50為45.39 μg/L,LOD為5.64 μg/L。

圖4 ELISA的標準曲線Fig.4 The standard inhibition cure of ELISA

2.4 方法的特異性

特異性是指抗體對相應(yīng)抗原或相似抗原的識別能力,ELISA檢測方法的特異性通常以交叉反應(yīng)率來表示。交叉反應(yīng)率實驗顯示,所建立的間接ELISA方法與蘇丹紅3號、剛果紅等其他競爭物幾乎不存在交叉反應(yīng)(表4),說明該方法具有較高的特異性。

表4 抗血清與幾種抑制物的交叉反應(yīng)率

注:-:未檢出(Not determined)。

2.5 方法的準確度

評價一種分析方法同時也要考慮到樣品基質(zhì)的影響,以便分析方法準確度和精密度。通過在空白蝦仁中添加三種不同濃度的AR73標準品,計算添加回收率和變異系數(shù),來評估此法的準確度和精密度。添加回收率范圍一般為60%～120%,最佳范圍在80%～100%,本實驗所建立間接ELISA方法的添加回收率范圍為71.3%～84.4%,RSD<9.55%,說明本方法準確可靠且平行性較好。

表5 AR73在空白蝦仁中的添加回收率(n=6)

3 結(jié)論

本實驗采用活性酯法和CDI法合成了AR73的人工抗原,經(jīng)紫外掃描法和SDS-PAGE電泳鑒定半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功,并對ELISA反應(yīng)體系進行優(yōu)化,建立了酸性紅73的間接競爭ELISA檢測方法。所制備的人工抗原及獲得的抗體,具有高稀釋倍數(shù)和較高的抗體效價,為下一步制備單克隆抗體,篩選出高特異性、靈敏度高的單抗具有一定的參考價值。但是由CDI法合成的免疫原未能誘導機體產(chǎn)生強特異性抗體,未能達到異源包被優(yōu)化ELISA方法的目的。因此,對于AR73有待于通過不同方法,篩選出一種新型具有高活性的人工抗原,更大程度的提高ELISA檢測的特異性和靈敏度,以便于推廣該方法在食品、藥材等其他方面的應(yīng)用。

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Development of an indirect ELISA for Acid Red 73 in Shrimps

CHANG Xiang-cai1,2,WEI Guo-lu1,+,MA Ming1,ZHANG Sheng-jun3,SHI Miao-xiao1,YANG Xiao-nong2,*

(1.College of Agriculture,Anshun University,Anshun 561000,China;2.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China;3.College of Resource & Environment,Anshun University,Anshun 561000,China)

Acid red 73(AR73)was coupled to bovine serum albumin(BSA)and ovalbumin(OVA)by the use of N-hydroxysuccinimide active method and the CDI method to prepare the immunogen and coating antigen,respectively. The anti-AR73 antibody were obtained and purified by the caprylic acid-ammonium sulfate method. Based on the IgG,an indirect competitive ELISA method and optimum reaction conditions for detection of AR73 was developed. The half of inhibition concentration(IC50)was 45.39 μg/L,the limit of detection for acid red 73 was 5.64 μg/L,and the cross-reactivity study showed that the polyclonal antiserum were highly specific to AR73,and no cross-reactivity was detected between the obtained polyclonal antiserum and the other competitors(Congo Red,Phenol Red,Safranine,Basic Fuchsin and Carmine)except to Sudan red Ⅲ(0.15%). The recoveries from the standards fortified blank samples were in the range of 71.3%～84.4% with Coefficient of Variance lower than 9.55%. This developed method can be used to determine the acid red 73 residue in shrimps,and can help to prepare the monoclonal antibody and develop the rapid test kits for acid red 73.

Shrimps;Acid Red 73;Active ester method;CDI method;ELISA

2014-10-08 +并列第一作者。

常向彩(1987-)，男，碩士，主要從事獸醫(yī)免疫學及藥物殘留快速檢測等研究，E-mail：changxiangcai31@126.com。 韋國陸(1992-)，男，本科，研究方向：生物科學，E-mail:1640175774@qq.com。

*通訊作者:楊曉農(nóng)(1963-)，男，博士，教授，主要從事小動物疾病方面的研究，E-mail：yangxn058@163.com。

貴州省科技廳聯(lián)合基金項目(黔科合J字LKA[2013]09號)。

TS207.4

A

1002-0306(2015)15-0298-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.054