李穎暢,張明輝,馬春穎,李作偉,李秀霞,張 笑

(1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院,遼寧錦州 121013;2.遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧錦州 121013;3.遼寧省高校重大科技平臺(tái)“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”,遼寧錦州 121013)

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取藍(lán)莓葉多酚

李穎暢1,2,3,張明輝1,馬春穎1,李作偉,李秀霞1,2,3,張 笑1,2,3

(1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院,遼寧錦州 121013;2.遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧錦州 121013;3.遼寧省高校重大科技平臺(tái)“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”,遼寧錦州 121013)

以藍(lán)莓葉粉末為材料,以超聲波輔助乙醇提取藍(lán)莓葉多酚,研究超聲時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度、料液比對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響,并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波輔助乙醇提取藍(lán)莓葉多酚的工藝條件。結(jié)果表明:超聲時(shí)間10 min,超聲功率546 W,乙醇濃度64%,料液比1∶22(g/mL),藍(lán)莓葉多酚得率為8.54%。超聲波輔助提取法操作簡(jiǎn)便、得率高,是適合藍(lán)莓葉多酚提取的一種工藝方法。

藍(lán)莓葉多酚,超聲波輔助法,提取工藝,響應(yīng)面設(shè)計(jì)

藍(lán)莓,又稱烏飯樹、越桔、藍(lán)漿果等,屬杜鵑花科越桔屬植物[1]。我國(guó)藍(lán)莓葉資源豐富,分布于全國(guó)各地。藍(lán)莓葉,一般為橢圓形或者長(zhǎng)圓形,全綠,藥食兩用。藍(lán)莓葉中含有多糖、多酚類化合物、氨基酸、脂肪酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、有機(jī)酸、維生素、礦質(zhì)元素、甾醇和萜類等[2-3]。多酚又名單寧、鞣質(zhì),是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)的混合物,是分子中具有多個(gè)羥基酚類植物成分的總稱[4]。植物多酚具有抗氧化、清除自由基、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤和抗病毒等生物活性[5-9]。超聲波提取技術(shù)是指利用頻率高于20 kHz的聲波通過(guò)超聲波輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)加快物質(zhì)的擴(kuò)散溶解,有效提高化合物提取率[10]。超聲波具有能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點(diǎn),適合熱敏物質(zhì)的提取。目前對(duì)藍(lán)莓的研究大多停留在藍(lán)莓果多酚的提取、生物活性等研究上,對(duì)藍(lán)莓葉多酚的研究還鮮有報(bào)道。本文采用超聲波輔助乙醇提取藍(lán)莓葉多酚,通過(guò)對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取工藝中超聲時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度、料液比等因素與藍(lán)莓葉多酚提取率關(guān)系的研究,結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,旨在探求藍(lán)莓葉多酚提取的最佳工藝條件,為藍(lán)莓葉多酚的深加工提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓葉(栽培品種“藍(lán)豐”) 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)科學(xué)發(fā)展研究院;沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所;Folin-Ciocalteu試劑 上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;乙醇、無(wú)水碳酸鈉,分析純 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

萬(wàn)能高速粉碎機(jī) 歐凱萊芙(香港)實(shí)業(yè)公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;722N可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;UV-1600型紫外-可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司;FA2004型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;Scientz-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多酚含量的測(cè)定 多酚含量的測(cè)定采用福林酚比色法[11]。多酚吸光度和多酚濃度的回歸曲線方程為y=0.0895x+0.0238(R2=0.9997),其中y是750 nm處多酚的吸光度,x是多酚濃度(mg/mL)。藍(lán)莓葉多酚的吸光度在750 nm處測(cè)定,多酚濃度根據(jù)回歸曲線方程計(jì)算,多酚得率根據(jù)以下公式計(jì)算。

多酚得率(%)=C×V×n×100/1000 m

其中:C是藍(lán)莓葉多酚濃度(mg/mL),V是提取樣品體積(mL),n是稀釋倍數(shù),m是藍(lán)莓葉的質(zhì)量(g)。

1.2.2 藍(lán)莓葉多酚超聲波輔助提取的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響 稱取2.00 g藍(lán)莓葉粉末,在料液比1∶25(g/mL),乙醇濃度60%,超聲波功率400 W的條件下,考察提取時(shí)間分別為4、6、8、10、12 min對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響。

1.2.2.2 超聲功率對(duì)多酚得率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g藍(lán)莓葉粉末,在超聲時(shí)間8 min,乙醇濃度為60%,料液比1∶25(g/mL)條件下,考察超聲功率分別為200、300、400、500、600 W對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響。

1.2.2.3 乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g藍(lán)莓葉粉末,在超聲時(shí)間為8 min,超聲波功率400 W,料液比1∶25(g/mL)的條件下,考察乙醇濃度為20%、40%、60%、80%、100%對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響。

1.2.2.4 料液比對(duì)多酚得率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g藍(lán)莓葉粉末,在超聲時(shí)間為8 min,超聲波功率為400 W,乙醇濃度為60%條件下,考察料液比為1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55(g/mL)對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取的工藝參數(shù),實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 8.0 軟件進(jìn)行4因素3水平Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響

從圖1可以看出,隨超聲時(shí)間的增加,藍(lán)莓葉多酚得率提高。當(dāng)超聲時(shí)間為8 min時(shí),多酚的得率達(dá)到最大值,為6.69%。超聲時(shí)間為10、12 min多酚得率略有降低,但和超聲時(shí)間8 min相比,多酚得率無(wú)顯著性(p>0.05)差異。可能隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng),超聲產(chǎn)生的熱量使提取液溫度升高,多酚有少量降解所致。石珂心等[12]超聲波輔助提取石榴籽多酚,超聲時(shí)間為31 min,本文提取藍(lán)莓葉多酚的超聲時(shí)間比提取石榴籽多酚短很多,可能是因?yàn)樘崛∷{(lán)莓葉多酚的功率比石榴籽多酚的高,導(dǎo)致提取時(shí)間縮短,也可能是藍(lán)莓葉多酚比石榴籽多酚容易提取。利用超聲波提取多酚可大大節(jié)約提取時(shí)間,Porto等[13]發(fā)現(xiàn)用常規(guī)的浸提提取葡萄籽多酚時(shí)間為12 h,而用超聲波提取只需15 min。從節(jié)約時(shí)間和成本考慮,選擇提取藍(lán)莓葉多酚的超聲時(shí)間為8 min。

表1 藍(lán)莓葉多酚提取Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素和水平

圖1 超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on theextraction yield of polyphenols from blueberry leaves

2.2 超聲功率對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響

從圖2可以看出,隨超聲功率提高,藍(lán)莓葉多酚得率增加,這可能是由于超聲波空化作用加快藍(lán)莓葉細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破碎使藍(lán)莓葉多酚更容易被提取。d’Alessandro等[14]報(bào)道超聲波使植物樣品組織能吸收更多的溶劑而膨脹,使細(xì)胞壁孔隙增大。在超聲功率為500 W時(shí),多酚得率達(dá)到最大值,之后超聲功率再提高,多酚得率略有降低。功率為600 W與500 W相比,多酚得率無(wú)顯著性(p>0.05)差異,說(shuō)明當(dāng)超聲功率達(dá)到一定程度,產(chǎn)生的熱量,導(dǎo)致部分多酚氧化損失,此時(shí)繼續(xù)增加超聲功率,藍(lán)莓葉多酚得率無(wú)顯著增加,選擇超聲功率為500 W。

圖2 超聲功率對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on theextraction yield of polyphenols from blueberry leaves

2.3 乙醇濃度對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響

從圖3可以看出,隨乙醇濃度的提高,多酚得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。乙醇濃度為60%時(shí),多酚的得率為6.69%;乙醇濃度為80%時(shí),多酚的得率為4.66%;而乙醇的濃度為100%時(shí),多酚的得率只有1.75%。這可能是因?yàn)橐掖紳舛鹊蜁r(shí)隨著乙醇濃度的增加,多酚類物質(zhì)在乙醇溶液中的溶解度增加,乙醇濃度超過(guò)60%后,溶劑與藍(lán)莓葉多酚之間的極性差距增大,導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的溶解度下降。最佳乙醇濃度為60%。

圖3 乙醇濃度對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration onthe extractionyield of polyphenols from blueberry leaves

2.4 料液比對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響

從圖4可以看出,隨著料液比的增加,多酚得率也隨之增加,當(dāng)料液比為1∶25(g/mL)時(shí),多酚得率達(dá)到最高,再增加料液比多酚得率反而降低,這可能是因?yàn)槿軇┻^(guò)少,溶液容易達(dá)到飽和,有效成分難以提取完全,而溶劑過(guò)多,原料中的雜質(zhì)也會(huì)溶出,使多酚得率降低,同時(shí)也會(huì)增加成本。因此,最佳料液比為1∶25(g/mL)。這與鮑建峰等[15]超聲提取香榧假種皮中總多酚的料液比是一致的。

圖4 料液比對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on theextraction yield of polyphenols from blueberry leaves

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.5.1 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 采用SAS8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,Box-Behnken的4因素3水平實(shí)驗(yàn)共27個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),前面24個(gè)是析因點(diǎn),自變量取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點(diǎn),后面3個(gè)為零點(diǎn),為區(qū)域的中心點(diǎn),用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差,每次所得藍(lán)莓葉多酚得率見表2,由Box-Behnken Design設(shè)計(jì)方案所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。運(yùn)用SAS程序?qū)憫?yīng)值進(jìn)行回歸分析,經(jīng)回歸擬和后得到回歸方程:Y=6.47+0.54X1+0.28X2+0.24X3+0.24X4+0.63X1X2-0.3X1X3-0.19X1X4+0.16X2X3-0.96X2X4+0.18X3X4+0.15X12+0.27X22-0.62X32-0.16X42。對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),從表3可以看出,作用顯著的是X2、X3、X4,極顯著的是X1,X1X2、X2X4,X32。從F值可以看出,對(duì)于該模型來(lái)說(shuō),各因素對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響排序?yàn)?超聲時(shí)間(X1)>超聲功率(X2)>乙醇濃度(X3)>料液比(X4)。

表2 提取藍(lán)莓葉多酚Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 提取藍(lán)莓葉多酚的方差分析

2.5.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化及模型驗(yàn)證 從結(jié)果來(lái)看,僅X1X2、X2X4交互作用極顯著,其響應(yīng)曲面圖為圖5,圖6。圖5為超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響,超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響是顯著的,但超聲時(shí)間的等高線更加密集,說(shuō)明超聲時(shí)間比超聲功率對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響更顯著。圖6為超聲功率和料液比對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率的影響,超聲功率對(duì)藍(lán)莓葉多酚得率影響更顯著。

由SAS8.0軟件分析得到響應(yīng)面值最大時(shí),X1、X2、X3、X4對(duì)應(yīng)的編碼值分別為0.99、0.92、0.40、-0.62,與之對(duì)應(yīng)的藍(lán)莓葉多酚超聲波輔助提取法的最佳工藝條件為:超聲時(shí)間9.89 min,超聲功率546 W,乙醇濃度64%,料液比1∶21.9(g/mL),此時(shí),藍(lán)莓葉多酚的理論得率達(dá)到8.54%。

為檢驗(yàn)響應(yīng)面的可靠性,采用得到的最佳提取工藝條件進(jìn)行藍(lán)莓葉多酚超聲提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),同時(shí)考慮實(shí)際操作的局限性,將工藝參數(shù)修正為超聲時(shí)間10 min,超聲功率546 W,乙醇濃度64%,料液比1∶22(g/mL)。在此修正條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)測(cè)得的藍(lán)莓葉多酚得率為8.42%,與理論預(yù)測(cè)值8.54%基本吻合,因此,采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

圖5 超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface showing the effects ofultrasound time and ultrasound power on extraction rate ofpolyphenols from blueberry leaves

圖6 超聲功率和料液對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface for the effects ofultrasound power and the ratio of material and liquid onextraction rate of polyphenols from blueberry leaves

3 結(jié)論

3.1 應(yīng)用SAS8.0軟件,采用Box-Behnken Design建立了超聲時(shí)間X1、超聲功率X2、乙醇濃度X3、料液比X4與藍(lán)莓葉多酚得率之間數(shù)學(xué)模型為

Y=6.47+0.54X1+0.28X2+0.24X3+0.24X4+0.63X1X2-0.3X1X3-0.19X1X4+0.16X2X3-0.96X2X4+0.18X3X4+0.15X12+0.27X22-0.62X32-0.16X42,回歸分析表明,相關(guān)系數(shù)R2=0.90197,表明回歸模型顯著,擬合程度好,有實(shí)際應(yīng)用意義;通過(guò)顯著性檢驗(yàn),各因素對(duì)結(jié)果影響排序?yàn)?超聲時(shí)間(X1)>超聲功率(X2)>乙醇濃度(X3)>料液比(X4)。

3.2 通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到最佳超聲波提取條件為:超聲時(shí)間10 min,超聲功率546 W,乙醇濃度64%,料液比1∶22(g/mL)。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到藍(lán)莓葉多酚得率為8.42%,該值與理論預(yù)測(cè)值8.54%基本吻合,說(shuō)明響應(yīng)面模型可預(yù)測(cè)理論得率并很好的應(yīng)用于藍(lán)莓葉多酚提取工藝條件的優(yōu)化。

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Optimization of ultrasound-assisted extraction of polyphenols from blueberry leaves by response surface method

LI Ying-chang1,2,3,ZHANG Ming-hui1,MA Chun-ying1,LI Zuo-wei,LI Xiu-xia1,2,3,ZHANG Xiao1,2,3

(1.College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Bohai University,Jinzhou 121013,China;2.Food Safety Key Lab of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China;3.Engineering and Technology Research Center of Food Preservation,Processing and Safety Control of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China)

Polyphenols from blueberry leaves were extracted by ethanol and ultrasonic-assisted. The effects of ultrasonic time,ultrasonic power,ethanol concentration and ratio of solid-liquid on the extraction were studied. Extraction process of polyphenols from blueberry leaves was optimized by response surface method. The conditions of ultrasonic extraction were optimized by single factor and response surface method:ultrasound time 10 min,ultrasound power 546 W,the concentration of ethanol 64%,the solid-liquid ratio 1∶22(g/mL),the total polyphenols extacted in this condition was 8.54%. The ultrasonic assisted extraction is simple and high of extraction rate,so it is a suitable process for the extraction of polyphenols from blueberry leaves.

polyphenols from blueberry leaves;ultrasound-assisted;extraction technology;response surface design

2014-11-05

李穎暢(1973-),女,博士,副教授,主要從事農(nóng)、水產(chǎn)品貯藏加工與質(zhì)量安全控制方面的研究，Liyingchangsy@sina.com。

國(guó)家自然基金(31201308)。

TS209

B

1002-0306(2015)15-0234-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.040