姜愛(ài)麗,胡文忠，*,崔曉亭,陳 晨,薩仁高娃,李佳慧

(1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

溫度及乳酸鏈球菌素對(duì)單增李斯特菌的抑制作用

姜愛(ài)麗1,胡文忠1，*,崔曉亭1,陳 晨1,薩仁高娃2,李佳慧1

(1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

通過(guò)Matlab軟件擬合Gompertz生長(zhǎng)模型,研究了溫度對(duì)單增李斯特菌(Listeria.monocytogenes,LM)的影響;同時(shí),研究了不同濃度(5、10、50、100、150 μg/mL)、pH(1、3、5、7、9)、溫度(45、75、95、115、121℃)條件下的乳酸鏈球菌素對(duì)LM殺菌活性的影響,旨在為L(zhǎng)M的監(jiān)控技術(shù)發(fā)展提供理論依據(jù)。結(jié)果表明:低溫的抑制效果明顯,最大細(xì)胞密度減少了4.3455 lg cfu/mL;乳酸鏈球菌素濃度低于5 μg/mL時(shí)能促進(jìn)LM的生長(zhǎng),高于10 μg/mL時(shí),對(duì)LM有一定的殺菌作用,高于150 μg/mL時(shí),48 h之內(nèi)幾乎可以殺死營(yíng)養(yǎng)肉湯中的所有LM;乳酸鏈球菌素對(duì)酸性有協(xié)同效應(yīng);并有較好的熱穩(wěn)定性。

單增李斯特菌,生長(zhǎng)模型,乳酸鏈球菌素,溫度,pH

李斯特菌是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性菌,共有七個(gè)種。其中單增李斯特菌(Listeria.Monocytogenes,LM)是唯一能引起人類(lèi)致病的病原菌,也是一類(lèi)人畜共患病的病原菌[1]。乳酸鏈球菌素又稱(chēng)乳球菌肽或乳鏈菌肽,英文名為Nisin,是N型血清的某些乳酸鏈球菌在代謝過(guò)程中合成和分泌的具有很強(qiáng)殺菌作用的小肽。盡管很多學(xué)者進(jìn)行了大量的研究,但目前對(duì)乳酸鏈球菌素的抑菌機(jī)理尚未定論。近年來(lái),部分學(xué)者又提出“孔道理論”,認(rèn)為乳酸鏈球菌素是一個(gè)疏水的帶正電荷的陽(yáng)離子分子,在一定膜電位存在下,可吸附于敏感菌的細(xì)胞膜上,通過(guò)C末端作用侵入細(xì)胞內(nèi)形成通透性孔道,細(xì)胞膜失去極化,細(xì)胞內(nèi)小分子流失,細(xì)胞外水分子的流入,造成細(xì)胞膜內(nèi)外能差消失,導(dǎo)致細(xì)胞自溶而死亡,總體上可以認(rèn)為,乳酸鏈球菌素對(duì)芽孢的作用是在萌發(fā)前期及膨脹期破壞其膜,抑制其發(fā)芽過(guò)程[2]。目前,針對(duì)單增李斯特菌的乳酸鏈球菌素控制技術(shù)國(guó)內(nèi)外研究很廣泛[3-5],但還沒(méi)有研究不同濃度乳酸鏈球菌素在不同pH和不同溫度下對(duì)LM的抑制作用方面的研究。本文研究了不同溫度下LM的生長(zhǎng)情況及不同條件下乳酸鏈球菌素抑制LM的效果,旨在為L(zhǎng)M監(jiān)控技術(shù)的發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株:LM標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院(編號(hào):GIM1.229);含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE) 青島海博生物技術(shù)有限公司;含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE) 青島海博生物技術(shù)有限公司;乳酸鏈球菌素:食品級(jí) 浙江銀像食品有限公司;鹽酸、氫氧化鈉、酒精 均為分析純。

HYC-326A醫(yī)用冷藏箱 青島海爾特種電器有限公司;MLS-3020 全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器 日本SANYO公司;DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YLE-1000電熱恒溫水浴鍋 北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司;AB135-S分析天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;Acol-super全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀 英國(guó)synbiosis公司;1300系列A2型二級(jí)生物安全柜 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;HR40-IIA2二級(jí)生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LM原菌落懸浮液的制備 在無(wú)菌室的生物安全柜里以無(wú)菌操作取TSA-YE斜面上的標(biāo)準(zhǔn)菌株,在TSA-YE平板上進(jìn)行劃線,36 ℃培養(yǎng)24 h后活化,接種單增李斯特菌單菌落于含150 mL TSB-YE中,充分混勻,將三角瓶放入36 ℃培養(yǎng)箱,培養(yǎng)5～12 h至初始菌落數(shù)大致為104～105cfu/mL,即原菌液,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 TSB-YE中LM計(jì)數(shù) 將制得的原菌落懸浮液置于36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),每隔4h取樣,采用涂布平板培養(yǎng)法[6]計(jì)活菌數(shù),計(jì)數(shù)平板為T(mén)SA-YE 。按下列公式計(jì)算每毫升樣品中的含菌量:每毫升樣品中的菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

用相同的方法,將原菌液分別置于4、25、30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔一定時(shí)間取樣計(jì)數(shù)。初級(jí)模型利用Matlab軟件建立Gompertz模型。

Gompertz模型:

Nt=A+C·exp(-exp(-B(t-M)))

式(1)

U=BC/e

式(2)

LPD=M-1/B

式(3)

MPD=A+C

式(4)

式中:t表示時(shí)間(h),Nt表示t時(shí)的菌數(shù),A表示初始菌數(shù)N0(lg cfu/mL),C表示最大菌數(shù)Nmax與初始菌數(shù)N0的差值(lg cfu/mL),B為在時(shí)間點(diǎn)M時(shí)的相對(duì)最大生長(zhǎng)速率(h-1),M表示達(dá)到最大生長(zhǎng)速率所需的時(shí)間(h),U表示微生物生長(zhǎng)的最大比生長(zhǎng)速率(lg cfu/mL·h),LPD表示微生物生長(zhǎng)的延滯期(h),MPD表示微生物生長(zhǎng)的最大細(xì)胞密度(lg cfu/mL),e=2.7182[7]。

1.2.3 不同濃度乳酸鏈球菌素溶液的配制 用0.02 mol/L HCl配制濃度為5、10、50、100、150 μg/mL的乳酸鏈球菌溶液(pH1.7)[5]。將原菌落懸浮液與上述制得的不同濃度的乳酸鏈球菌素溶液以體積比1∶10進(jìn)行混合。充分振蕩3 min。然后用無(wú)菌生理鹽水對(duì)上述混合液進(jìn)行梯度稀釋。取100 μL稀釋液涂布于TSA-YE平板上,在36 ℃培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)錄活菌數(shù)。

1.2.4 不同pH乳酸鏈球菌素溶液的配制 配制不同濃度下的乳酸鏈球菌素溶液,采用濾膜過(guò)濾以達(dá)到消毒的效果,用濃度為1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)乳酸鏈球菌素溶液的pH,最終調(diào)制成不同的pH(1.0,3.0,5.0,7.0,9.0),進(jìn)行抑菌效果實(shí)驗(yàn)。同樣將原菌落懸浮液和不同pH下的一定濃度的乳酸鏈球菌素溶液以體積比1∶10進(jìn)行混合,充分震蕩3 min,并將上述混合液進(jìn)行梯度稀釋。然后將上述稀釋液用移液槍取100 μL涂布在TSA-YE平板上,放置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.2.5 不同溫度對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響 用濃度為0.02 mol/mL 的稀鹽酸溶液配制濃度為10 mg/mL的乳酸鏈球菌素(pH1.7),濾膜過(guò)濾消毒,分別將其在不同的溫度(45、75、95、115、121 ℃)下加熱20 min,以36 ℃條件下的乳酸鏈球菌素原液作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照,進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用 SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析,用Microsoft Office Excel作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溫度下的LM在TSB-YE中的生長(zhǎng)曲線及模型參數(shù)

由Matlab軟件擬合LM在TSB-YE中的Gompertz生長(zhǎng)模型,見(jiàn)圖1。R2及得到相應(yīng)的生長(zhǎng)參數(shù):最大比生長(zhǎng)速率U,生長(zhǎng)延滯期LPD和最大細(xì)胞密度MPD,結(jié)果見(jiàn)表1?？梢钥闯?由Gompertz模型擬合的生長(zhǎng)曲線都很好,R2均在0.9937以上。不同溫度下LM的最大比生長(zhǎng)速率U的排列順序如下所示,4 ℃<25 ℃<30 ℃<36 ℃。隨著溫度的升高,LM在不同溫度下生長(zhǎng)延滯期的順序?yàn)? ℃>25 ℃>30 ℃>36 ℃。隨著溫度的升高,最大細(xì)胞密度MPD增加,LM在不同溫度下生長(zhǎng)最大細(xì)胞密度的順序?yàn)? ℃<25 ℃<30℃<36 ℃,4 ℃時(shí)MPD較36 ℃時(shí)減少4.3455 lg cfu/mL。綜上所述,隨著溫度的升高,U增大,LPD減小,MPD增加。36 ℃時(shí)最適宜LM生長(zhǎng),4 ℃時(shí)LM的生長(zhǎng)緩慢。該結(jié)果顯示的趨勢(shì)與其他研究者的相同[7],溫度越低,微生物中各種酶的活性受到抑制,導(dǎo)致生長(zhǎng)速度逐漸變慢。

圖1 不同溫度下用Gompertz模型擬合出的LM在TSB-YE中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of LM in TSB-YE fit withGompertz model under different temperatures

2.2 乳酸鏈球菌素濃度對(duì)其抑菌性的影響

由表2可知,當(dāng)乳酸鏈球菌素濃度低于5 μg/mL時(shí),對(duì)單增李斯特菌的生長(zhǎng)沒(méi)有起到抑制的作用,反而起了促進(jìn)其生長(zhǎng)的作用。當(dāng)乳酸鏈球菌素的濃度高于10 μg/mL時(shí),對(duì)LM發(fā)揮殺菌的作用。當(dāng)乳酸鏈球菌素濃度高達(dá)150 μg/mL時(shí),在48 h內(nèi)幾乎可以將培養(yǎng)基中的所有LM殺死(p<0.05)。

2.3 不同pH對(duì)乳酸鏈球菌素抑制單增李斯特菌的影響

由圖2可以看出,隨著pH的變化,乳酸鏈球菌素的抑菌及殺菌效果也隨之發(fā)生了改變。乳酸鏈球菌素的濃度越高,pH越低,則抑菌或殺菌效果越強(qiáng)。當(dāng)pH為1時(shí),乳酸鏈球菌素的濃度為100 μg/mL時(shí),48 h內(nèi)可以使LM的活菌數(shù)低于檢測(cè)限。當(dāng)pH>7時(shí),乳酸鏈球菌素濃度低于10 μg/mL時(shí),沒(méi)有殺菌的作用。當(dāng)pH<5時(shí),乳酸鏈球菌素濃度高于10 μg/mL時(shí),對(duì)LM起到了殺菌的功效。結(jié)果表明,乳酸鏈球菌素在偏酸性條件下殺菌活性比較強(qiáng),偏中性及堿性則殺菌效果不明顯(p<0.05)。

圖2 不同pH對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響Fig.2 Effect of pH on activity ofanti-bacteria with Nisin

2.4 不同熱處理溫度對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響

由圖3可以看出,將乳酸鏈球菌素加熱到45 ℃后其所表現(xiàn)出的抑菌活性最高,而加熱到121 ℃時(shí)乳酸鏈球菌素所表現(xiàn)出的抑菌及殺菌活性最差,不過(guò)其抑菌活性仍然高于未經(jīng)熱處理時(shí)的乳酸鏈球菌素的抑菌活性。結(jié)果表明,將乳酸鏈球菌素經(jīng)過(guò)加熱處理后,它的抑菌活性雖然有略微的提高,不過(guò)提高的程度很小,與對(duì)照(36 ℃)相比差異不顯著(p>0.05)。說(shuō)明乳酸鏈球菌素對(duì)熱有較好的穩(wěn)定性。

圖3 加熱處理對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響Fig.3 Effect of pre-heating on activityof anti-bacteria with Nisin

3 結(jié)論

微生物生長(zhǎng)的初級(jí)模型一般是由S形生長(zhǎng)曲線描述[8-10],雖然有多種模型能夠擬合微生物的生長(zhǎng)曲線,但Gompertz模型能更好地描述微生物的生長(zhǎng)及變化[11]。從不同的溫度下LM生長(zhǎng)的最大比生長(zhǎng)速率可以看出,36 ℃時(shí)生長(zhǎng)延滯期最短為1.7054,是這4個(gè)溫度中最適宜LM生長(zhǎng)繁殖的溫度。4 ℃時(shí)LM生長(zhǎng)極其緩慢,延滯期長(zhǎng)達(dá)約32 h,最大細(xì)胞密度為4.0517,雖然生長(zhǎng)極其緩慢,但在此溫度下仍具有一定的生長(zhǎng)量。

表1 在不同溫度下Gompertz模型擬合的LM在TSB-YE中的生長(zhǎng)曲線的R2和生長(zhǎng)參數(shù)

表2 不同濃度的乳酸鏈球菌素條件下的LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中的的活菌數(shù)量(lg cfu/mL)

乳酸鏈球菌素的初始濃度對(duì)其抑菌性活性有顯著影響,當(dāng)其濃度低于5 μg/mL時(shí),乳酸練球菌素不但沒(méi)有抑制LM的生長(zhǎng),反而促進(jìn)了LM的生長(zhǎng)。當(dāng)乳酸鏈球菌素的濃度高于10 μg/mL時(shí),具有一定的抑菌及殺菌作用。當(dāng)濃度高達(dá)150 μg/mL時(shí),可以在48 h之內(nèi)將培養(yǎng)基中的LM全部殺死。正如文獻(xiàn)[12]報(bào)道,因?yàn)檩^高濃度的乳酸鏈球菌素吸附在細(xì)胞膜上,進(jìn)而使得LM的細(xì)胞壁中的肽聚糖的形成受到了影響,使得細(xì)胞膜和磷脂類(lèi)物質(zhì)的代謝合成受阻,最終結(jié)果導(dǎo)致LM細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)向外滲漏,LM細(xì)胞由于裂解而死亡。以此達(dá)到抑菌或殺菌的效果。

隨著pH的不斷升高,乳酸鏈球菌素的抑菌及殺菌活性表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH為1時(shí),乳酸鏈球菌素的濃度為100 μg/mL時(shí),在48 h之內(nèi)能使LM活菌數(shù)量降低到規(guī)定的檢測(cè)限之下[13-14]。結(jié)果表明乳酸鏈球菌素在酸性條件下表現(xiàn)出更為穩(wěn)定的抑菌效應(yīng)。

乳酸鏈球菌素經(jīng)過(guò)加熱處理后,其抑菌活性雖然有所提高,但整體所表現(xiàn)出的變化幅度很小,說(shuō)明乳酸鏈球菌素在較高的溫度下有很好的熱穩(wěn)定性。

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Inhibition of temperature and Nisin onListeriamonocytogenes

JIANG Ai-li1,HU Wen-zhong1,*,CUI Xiao-ting1,CHEN Chen1,Sa-ren-gao-wa2,LI Jia-hui1

(1.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;2.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

The effect of different temperatures on growth ofListeriamonocytogenes(LM)was studied,and Gompertz model was fit using Matlab software. In order to provide theory foundation for the development of supervisory technique,the antibacterial activity of Nisin under the different concentrations(5,10,50,100,150 μg/mL),pH(1,3,5,7,9)and temperatures(45,75,95,115,121 ℃)were studied simultaneously. The results demonstrated that low temperature appeared significantly inhibiting effect,the maximum cell density was reduced by 4.3455 lg cfu/mL. The growth of LM was promoted when the concentration of Nisin was<5 μg/mL. The bactericidal effects was the concentration of Nisin>10 μg/mL. When the concentration of Nisin was>150 μg/mL,it was able to kill almost allL.monocytogenesin nutritional broth during the period of 48 h cultivation. Nisin has a synergistic effect under acidic environment and a good thermal stability.

Listeriamonocytogenes;growth model;Nisin;temperature;pH

2014-10-21

姜愛(ài)麗(1971-),女,博士,副教授,研究方向:采后生物學(xué)與技術(shù),E-mail:jal@dlnu.edu.cn。

*通訊作者:胡文忠(1959-),男,博士,教授,研究方向:食品科學(xué)與工程,E-mail:hwz@dlnu.edu.cn。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD38B05);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31172009);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(DC2013010107);遼寧省科技廳基金。

TS201.3

A

1002-0306(2015)15-0157-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.025